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肺癌死亡率在世界范围内居恶性肿瘤的首位，5年生存率仅为7％。NSCLC占肺癌的75％-80％左右，化疗在其治疗中仍发挥重要作用。抗癌药物主要通过诱导肿瘤细胞凋亡来发挥其治疗作用，传统化疗药因非选择性杀伤作用和毒副反应限制了其临床应用。近年来，中草药作为抗肿瘤药及新的化疗佐剂已经引起了广泛的关注。 紫草素(shikonin)是从传统中药紫草中分离出的主要活性成分，属萘醌类化合物，具有多种生物学活性，主要具有抗炎及抗肿瘤等作用。近年来的研究发现，紫草素能够诱导多种肿瘤细胞凋亡，但其诱导凋亡的确切机制仍不清楚。 p53为抑癌基因，它通过引起细胞周期阻滞和细胞凋亡来维持基因组的稳定性，在防止肿瘤的发生发展中扮演着非常重要的角色。研究表明，p53参与了紫草素诱导的Hela细胞、结肠癌细胞及黑色素瘤细胞凋亡，p53是否参与了紫草素诱导的A549细胞凋亡尚不清楚。 磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)/Akt信号转导通路在维持细胞生存和抑制细胞凋亡中起关键作用。在多种肿瘤细胞中均存在PI3K/Akt通路的异常活化，许多细胞毒药物通过抑制PI3K/Akt通路诱导细胞凋亡。但PI3K/Akt通路在紫草素诱导的肺癌细胞凋亡中的作用尚未见报道。 Cbl属泛素化连接酶E3，它参与多种信号通路的传导并影响细胞功能。Cbl参与了MAPK、胰岛素通路及PI3K/Akt信号通路的调节。Cbl是否参与了紫草素诱导的A549细胞凋亡尚未有报道。 目前关于紫草素诱导肺癌细胞凋亡机制的研究尚未有报道。本实验以非小细胞肺癌A549细胞为模型，在紫草素诱导其凋亡过程中对Bax、Bcl-2及p53等蛋白表达的情况进行了研究，同时对PI3k/Akt通路上游分子泛素连接酶Cbl-b及c-Cbl在此过程中的调控机制进行了初步探讨。 材料和方法: 1、采用MTT法测定细胞活力。 2、采用流式细胞仪通过PI染色进行细胞周期解析。 3、采用流式细胞仪通过AnnexinⅤ-PI双染进行细胞凋亡检测。 4、采用Hoechst33342染色，共聚焦显微镜下观察细胞核染色质凝集及核碎裂。 5、采用Western-blot检测Bcl-2、Bax、p53、Akt，p-Akt、Cbl-b和c-Cbl蛋白的表达。 结果: 1、MTT结果显示紫草素对A549细胞的增殖抑制呈时间及剂量依赖性，24h及48h抑制细胞增殖50％的药物浓度(IC50)分别为1.75umol/L及1.25umol/L。 2、PI单染流式细胞仪检测结果显示紫草素诱导A549细胞出现G2/M期阻滞，1.5 umol/L及1.8umol/L紫草素作用24h的G2/M期细胞百分数分别为12.65±2.24％(P＜0.05)及17.27±3.27％(P＜0.01)。 3、AnnexinⅤ-PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡分析表明，紫草素作用于A549细胞24h，随浓度的增高，早期凋亡和晚期凋亡细胞的比例都逐渐增加，与对照组相比差异具有显著性(P＜0.01)。 4、紫草素作用于A549细胞24h，经Hoechst33342染色，共聚焦显微镜下观察细胞出现明显的染色质凝集及核碎裂。 5、Westem-blot结果显示紫草素能明显上调A549细胞的p53及Bax蛋白表达，下调Bcl-2蛋白表达。 6、1.8umol/L的紫草素分别作用于A549细胞4-24h，p-Akt蛋白表达在4h开始下降，24h时时达最小表达，而总Akt蛋白水平没有变化，提示紫草素可抑制PI3K/Akt信号通路。预先用PI3K特异性抑制剂LY294002处理A549细胞1小时，然后加入1.8umol/L的紫草素继续作用24h，MTT结果显示细胞增殖抑制率由单药紫草素组的48.06±3.21％增加至72.43±5.62％(P＜0.01)。流式分析仪显示细胞凋亡率由17.58±2.57％增加至42.61±4.36％(P＜0.01)，而LY294002单独作用24h仅轻度抑制A549细胞增殖，诱导少量细胞凋亡，说明LY294002与紫草素在抑制A549细胞增殖及诱导凋亡方面具有协同作用。 7、1.8umol/L紫草素分别作用A549细胞4-24h，Wester-blot结果显示Cbl-b及c-Cbl蛋白表达在4h时开始增加，24小时时达最大表达，两者上调时间与Akt活性被抑制的时间一致。用PS-341预处理细胞1小时，加入1.8umol/L紫草素继续作用24h，结果显示，PS-341逆转了紫草素对Akt活性的抑制作用及对A549细胞凋亡的诱导作用，提示Cbl-b及c-Cbl通过负性调节PI3K/Akt信号通路参与了紫草素诱导的A549细胞凋亡。 结论: 1、紫草素以时间和剂量依赖性方式抑制肺癌A549细胞增殖。 2、紫草素能够诱导A549发生G2/M期阻滞及细胞凋亡，同时上调了p53及Bax蛋白表达，下调了Bcl-2蛋白表达。 3、紫草素在诱导肺癌A549细胞凋亡过程中抑制了PI3K/Akt通路，LY294002同紫草素在A549细胞的增殖抑制及凋亡诱导方面具有协同作用。 4、紫草素在诱导A549细胞诱导过程中上调了Cbl-b及c-Cbl蛋白表达， Cbl-b及c-Cbl通过负性调节PI3K/Akt通路参与了紫草素诱导的A549细胞凋亡。