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骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSCs)是存在于骨髓中由中胚层发育的一类非造血干细胞,具有多向分化潜能,不仅能分化为造血细胞,还能分化成多种造血以外的组织细胞,特别是中胚层和神经外胚层来源的组织细胞。MSCs在多个领域,如细胞治疗、组织工程、发育生物学、基因功能研究、药物筛选等领域展示了巨大的应用前景。目的：了解大鼠骨髓间质干细胞体外培养特性,探讨MSCs的体外分离、培养、扩增的规律和特点。建立SD大鼠骨髓间充质干细胞体外培养体系。方法：1.原代培养,取一月龄SD大鼠股骨和胫骨,采用全骨髓培养法,以L-DMEM完全培养基冲出骨髓过滤后直接接种于培养瓶中,3天后首次换液,以后每3天换液一次。至细胞融合达80%以上时,进行传代。2.大鼠骨髓间质干细胞体外扩增的研究,取第1、4、7、10、13代细胞,观察其细胞生长曲线及贴壁率。3.大鼠骨髓间质干细胞表面标志的鉴定,取第4代细胞,采用流式细胞仪检测。结果：1.贴壁筛选法,通过多次换液可以分离、纯化MSCs,该法简单、方便、效果好。2.MSCs在体外培养中有很强的增殖能力,10代以前的细胞形态较一致,增殖能力强,随传代次数的增加,增殖能力减弱,形态发生不规则变化。细胞生长的第1、4、7、10、13代的贴壁率变化规律基本相同,无显著区别。传代后细胞贴壁率随时间延长而增高。3.MSCs的表面标志抗原呈现多样性的特征,MSCs不表达造血细胞表面抗原CD34、CD45,说明MSCs非造血类细胞；而其表达CD90、CD44,说明MSCs的表面标志具有非单一性的特性。它表达了间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志。结论：本实验采用骨髓直接培养,贴壁筛选法来分离培养MSCs,方法简单,效果亦可靠,通过数代的传代扩增就能获得高纯度、高数量的MSCs,以满足组织工程实验研究的需要。目的：1.构建pEGFP-N1-BDNF质粒。2.获得到稳定表达BDNF的MSCs,并转染大鼠骨髓间质干细胞(MSCs),观察其在MSCs内的表达。方法：用RT-PCR法从大鼠骨髓间充质干细胞中扩增出带有XhoⅠ、BamH工酶切位点的BDNF基因片段,将BDNF基因片段克隆到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因真核表达载体pEGFP-N1上,构建pEGFP-N1-BDNF质粒。通过电转染将pEGFP-N1-BDNF转染入大鼠MSCs。结果：pEGFP-N1-BDNF真核表达载体构建成功,荧光显微镜下观察,pEGFP-N1-BDNF表达载体转染到MSCsl2h后可见BDNF融合蛋白表达。结论：1.成功的构建pEGFP-N1-BDNF质粒。2.pEGFP-N1-BDNF质粒可以转染真核细胞HEK293细胞,证明BDNF-EGFP融合蛋白真核表达质粒可以在真核细胞表达。3.通过电转染和抗性筛选我们获得到了稳定表达BDNF的MSCs。目的：1.采用p-硫基乙醇(p-ME)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)作为诱导剂,对骨髓间充质干细胞(MSCs)进行体外诱导实验。探讨β-ME和bFGF体外诱导骨髓间充质干细胞分化神经元细胞的机制。2.探讨BDNF基因修饰对MSCs分化神经元细胞的影响。方法：1.MSCs向神经元细胞诱导分化,取P4代的MSCs和BDNF-MSCs,分别以2×104/ml浓度接种于24孔板内,待细胞达到70%-80%融合时,分别加入p-硫基乙醇(p-ME)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),倒置相差显微镜下连续观察细胞形态变化。2.细胞免疫荧光鉴定,采用细胞免疫荧光方法,对以上两组细胞诱导后5h后检测神经元标志物TuJ1的表达情况,荧光显微镜下观察并拍照记录。3.MSCs诱导为神经元细胞阳性率比较,荧光显微镜下在两组细胞随机取300个细胞,计数TuJ1反应阳性细胞个数,检验各组不同时间点的差异,以及每个时间点各组间的差异。结果：1.第4代MSCs加入诱导剂后可分化为神经元细胞和星形胶质细胞。可见光下观察：前者细胞体积较小数量较少,常有数个短小突起和一个较长的突起,呈典型的双极、多极或锥形,具有较强的折光性；后者细胞体积较大,细胞突起较多且粗,有些形态呈星状,有许多突起呈放射状伸出,平铺在培养皿上。2.细胞免疫荧光结果示细胞诱导后5h,部分细胞TuJ1反应阳性,为神经元细胞。3.两组MSCs诱导为神经元细胞阳性率比较,BDNF-MSCs组分化为神经元细胞的阳性率高于MSCs组,并具有统计学意义。结论：1.在体外MSCs在诱导剂bFGF和β-ME的作用下可分化为神经元样细胞。2.经过BDNF基因修饰,可以显著提高MSCs向神经元细胞分化的阳性率。