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哈蟆油(Oviductus Ranae)为蛙科动物中国林蛙(Rana temporaria chensinensis David)雌蛙输卵管的干制品,为长白山地区传统的道地药材,具有养阴润肺、补肾益精、健脾养胃之功效。现代药理学研究表明,具有良好的镇咳平喘、抗疲劳、抗衰老和增强免疫力等方面疗效。本文主要对哈蟆油化学成分、质量控制和药效成分药代动力学进行系统研究,对药材的评价控制和药效成分开发提供研究依据。1主要药效成分的分离利用柱层析色谱配合制备液相方法,对哈蟆油主要药效部位甾体类成分进行分离,结合光谱技术进行鉴定,共分离鉴定7种甾体类和5种脂肪酸酯类化合物,其中7-去氢胆固醇、胆甾-4,6-二烯-3-醇、豆甾醇、菜油甾醇、9-十八碳烯酸乙酯,9-十八碳烯酸甲酯,5,8,11,14-二十碳四烯酸甲酯,十八碳酸甲酯,十六碳酸甲酯,9种化合物均为首次从哈蟆油中分离得到。通过高速逆流色谱法,分别分离、制备了哈蟆油中胆固醇、7-羟基胆固醇和7-酮基胆固醇,其纯度分别为95.9%,96.5%和97.2%。2质量鉴别的研究2.1 TLC哈蟆油药材鉴别方法本文建立一种哈蟆油薄层色谱(TLC)鉴别方法,比较原有的哈蟆油薄层鉴别方法,增加了胆固醇、7-羟基胆固醇、7-酮基胆固醇和LD-2作为对照物质,以254nm紫外灯光下和喷以10%硫酸乙醇溶液检视,结果斑点清晰,分离度良好,具有良好的专属性,与原有方法相比更具优越性。此方法具有快速、准确、成本低廉等优势,可作为哈蟆油鉴别的参考方法,弥补药典中无薄层色谱鉴别项。2.2哈蟆油指纹图谱的建立通过HPLC-UV法对14批不同产地的哈蟆油样品进行分析,建立哈蟆油指纹图谱,与原有方法相比更具优越性,共有峰由原来的12个提升至33个,并指认了5种哈蟆油主要药效成分的色谱峰,分别为1-甲基海因、胆固醇、7-酮基胆固醇、7-去氢胆固醇和豆甾醇,优越性明显。此方法对哈蟆油药材的鉴别具有重大意义,可以更为完整的评价哈蟆油的质量,更具专属性和准确性。同时对哈蟆油的质量控制提供了理论依据。2.3一测多评法测定哈蟆油中甾体类成分本实验以胆固醇为内参物,对哈蟆油中7-羟基胆固醇、7-酮基胆固醇、胆甾4-烯-3酮、豆甾醇、7-去氢胆固醇与胆固醇之间相对保留时间和相对校正因子进行测定,建立了哈蟆油主要甾体类成分“一测多评”的测定方法。依照此法对哈蟆油中6种甾体类成分进行测定,并与外标法进行比较,结果表明两种测定方法结果无显著性差异,结合方法学试验证明此方法准确、可行,可用于哈蟆油中7-羟基胆固醇、7-酮基胆固醇、胆甾4-烯-3酮、豆甾醇、7-去氢胆固醇和胆固醇的含量测定,可省去除胆固醇外其它标准品的使用,简化实验、节约实验成本。此方法具有准确、高效、简便的优势,可应用于哈蟆油质量控制。3药代动力学研究3.1 1-甲基海因胃肠稳定性的研究本文建立一种快速、稳定、简便的测定方法,可以对1-甲基海因在人工胃液和人工肠液中的稳定性进行测定。通过比较3μg/ml、10μg/ml、15μg/ml高、中、低浓度样品在人工胃液和人工肠液中24h稳定性的测定,表明1-甲基海因只有极少量会降解,24h降解量不大于3%,具有相对较好的稳定性,推测其口服给药后,在胃液和肠液的p H下保持稳定,不会因降解受到影响,对其药代动力学的研究提供了依据。3.2 1-甲基海因血药浓度的研究首次对1-甲基海因的药代动力学实验进行研究,建立一种对1-甲基海因血药浓度测定的方法,专属性、精密度、稳定性、准确度、回收率结果均符合要求。通过测定灌胃给药,剂量分别为20mg/kg、50mg/kg、100mg/kg和尾静脉注射给药,剂量为3mg/kg的血药浓度,利用DAS 2.0软件对药代动力学参数进行计算、分析。研究发现口服1-甲基海因在体内吸收较快,20mg/kg、50mg/kg和100mg/kg的Tmax分别为2.0±0.55h、1.5±0.63h和1.292±0.459h,且消除也较快,T1/2约0.64h、0.75h和0.797h。并对其生物利用度进行计算,测定结果为18.84±2.21%。本文首次对1-甲基海因大鼠体内的血药关系进行研究,对1-甲基海因的临床使用和对药物研发奠定基础。3.3 1-甲基海因血浆蛋白结合率的研究首次对1-甲基海因血浆蛋白结合率进行研究,建立一种对1-甲基海因血浆蛋白结合率测定的方法,专属性、精密度、稳定性、准确度、回收率结果均符合要求。对0.2μg/ml、5μg/ml和50μg/ml药物浓度下的血浆蛋白结合率进行测定,其蛋白结合率约为24.36±0.93%、23.93±0.68%、.25.29±0.84%,属于较低蛋白结合率的物质,与半衰期较短的结果相符。比较0.2μg/ml、5μg/ml和50μg/ml浓度下血浆蛋白率结果,确定在测定范围内1-甲基海因血浆蛋白结合率不具有浓度依赖性。3.4 1-甲基海因药物组织分布的研究首次对1-甲基海因药物组织分布进行研究,建立一种高效、快捷、准确的测定方法,专属性、精密度、稳定性、准确度、回收率结果均符合要求。灌胃给药,剂量为50mg/kg,测定给药后0.5h、1h、2h、4h、6h、12h时药物在心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠脏器中的含量。结果1-甲基海因能够快速的分布于大鼠的各脏器中,约1h时各器官具有较高的浓度,达到顶峰;约3h时,各脏器药物浓度基本减少1/2以上;约6h时,各脏器药物浓度只剩下少微量,大部分已经被消除;12h时,各脏器中已经检测不到药物,已经完全消除,说明1-甲基海因在各组织中不易造成蓄积现象。3.5 1-甲基海因体内排泄的研究首次对1-甲基海因的排泄量进行研究,建立一种高效、快捷、准确的测定方法,专属性、精密度、稳定性、准确度、回收率结果均符合要求。通过实验结果可知,灌胃给予1-甲基海因,剂量为50mg/kg,96h内通过尿液和粪便总的排泄量约占总剂量的约为19.22%,其中尿液排出约15.58±4.48%,粪便排出约3.37±0.71%,说明药物主要通过尿液的方式排出。原药排出的总量只占给药剂量的少部分,说明1-甲基海因在复杂的体内环境,可能存在生物转化,发生结构的变化。