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阿朴脂蛋白是脂蛋白的重要组成成分,在脊椎动物的脂类运输中起着重要的作用。14kDa阿朴脂蛋白(Apo-14)作为鱼类特有的载脂蛋白已经在很多鱼中被分离鉴定出来,但是有关斑马鱼Apo-14的cDNA及其调控序列一直没有报道。为了更好地理解Apo-14在斑马鱼胚胎发育中的时空分布模式及其生理功能,在本试验中我们分离鉴定了斑马鱼Apo-14的cDNA序列和5’侧翼序列,并利用此5’侧翼序列驱动绿色荧光蛋白报告基因在组织特异性表达得到了转基因斑马鱼Tg(apo14:GFP)。在该转基因鱼中绿色荧光蛋白表现为母源传递,在分裂球中表达；随着合子基因的表达首先出现在卵黄核包层(YSL),在发育的后期集中在肝脏直到成鱼,于是利用Tg(apo14:GFP)转基鱼我们详尽地描述了肝脏生长阶段的形态发生。在Tg(apo14:GFP)转基鱼中,在受精后20小时首先在左侧内胚层可以看到绿色荧光信号；通过组织切片在受精后2天的幼鱼中可以看到在消化道左侧增殖形成的肝脏原基细胞团；随着肝脏原基的生长,到受精后3天肝细胞中的血寞逐渐形成:从受精后4天肝脏左叶沿消化道腹部伸向右侧,形成肝脏的右叶；到受精后7天肝脏血窦中充满了丰富的血液,直到受精后15天左右,在两叶之间的腹侧又形成第三叶,沿消化道向腹后方生长,直至成年斑马鱼中都可以看到明显的三叶肝脏。
接着我们又将Apo-14的ORF融合到GFP的N端,利用同样的启动子构建了第二个转基因品系Tg(apo14:ORF+GFP),在该转基因鱼中GFP融合蛋白呈现分泌性表达,在卵黄细胞中分布,在发育后期从肝脏中分泌到血浆中在鱼体全身流动。总之,利用这两种转基因鱼品系可以准确地呈现斑马鱼Apo-14在体的时空分布模式,揭示其在鱼类营养运输中作用。
此外,我们还从银鲫原肠期胚胎SMART cDNA文库中扩增了果糖-1,6-二磷酸酶基因的全长cDNA,其长度为1170bp,编码337个氨基酸残基,多重序列比对和系统发育分析表明该基因为肝脏型果糖-1,6-二磷酸酶。RT-PCR分析虽在银鲫的肝、脑、心、脾、肾、肠、肌肉和卵巢组织中皆能检测到该基因的表达,但以肝组织的表达量最高。Western Blot检测表明,肝脏组织除有一条与其它组织(肌肉除外)共有的蛋白带之外,还有一条特异带:肌肉中有不同于其他组织的特异带。成熟卵子和不同发育阶段胚胎的RT-PCR和Western Blot分析都可检测到母源的CagFbp转录本和蛋白,且其转录本从原肠期开始上升,到神经胚时迅速上升到较高水平,其蛋白从尾芽期以后出现一条比母源蛋白分子量小、与肝脏的特异带大小基本相同的蛋白带。这些结果证实本研究克隆的CagFbp为肝脏型,且鱼类至少存在肝脏型和肌肉型两种果糖-1,6-二磷酸酶同工酶。