论文部分内容阅读
头索动物文昌鱼代表无脊椎动物到脊椎动物的过渡类型，由于其独特进化地位，可以作为研究免疫系统起源与进化的理想模型，又因为其结构简单且具脊椎动物的基本特征，研究它对研究复杂的高等脊椎动物有重要的指导意义。比较免疫学的兴起和美国佛罗里达文昌鱼全基因组序列的完成，为研究文昌鱼提供了很好的契机。本论文对文昌鱼的模式识别分子amphi-BPI以及补体系统进行系统的研究。
研究结果主要包括以下几个方面：
1)在文昌鱼中克隆得到一个脂质转移/脂多糖结合蛋白家族成员amphi-BPI，并对其进行了系统的研究。通过原位杂交分析，发现文昌鱼amphi-BPI基因在肝盲囊、消化道和卵巢中高表达，并且RT-PCR分析表明该基因在成体受到LPS刺激24 h后显著上调，表明amphi-BPI是个参与免疫反应的急性期应答蛋白。重组表达了amphi-BPI的N端结构域蛋白进行功能研究，发现该蛋白具有哺乳动物BPI的杀菌活性以及与LPS的强烈亲和力，结合序列分析结果，我们推测，BPI和LBP的祖先基因具有BPI功能，而后经过基因复制，一个保留原有功能，另一个进化成了LBP。最后对文昌鱼amphi-BPI的多剪接体现象进行了探讨，提出了文昌鱼的amphi-BPI与环境共进化，剪接体多样性与个体自身及环境密切相关的观点。
2)对文昌鱼的补体系统进行全基因序列分析，发现文昌鱼拥有数量极多CLR(collagen-like region)-gC1q domain、CLR-CTLD和CLR-FBG结构形式的gene model，建树分析均作为脊椎动物相关序列分支的外群，可见它们是脊椎动物C1q、MBL和ficolin的祖先序列，而数量的众多可能为基因功能进化作储备。分析还发现4个因子B/C2的gene model，说明文昌鱼的旁路激活途径也很强大。此外还在基因组中分析发现大量的补体功能相关的结构域模块，如VWA、LDLa、MACPF、CUB、CCP、SP和FIMAC等，说明文昌鱼已经具备比较完整的补体系统。
3)根据MBL和ficolin特异性识别GlcNAc的特性，我们利用GlcNAcagarose column从文昌鱼体液中提取纯化得到了特异蛋白，并制备高效特异的多克隆抗体进免疫组化分析。
4)从文昌鱼中克隆得到MASP1/3、ficolin、C3、C6和因子B等分子，并进行功能相关实验。成体切片原位杂交显示MASP1/3、C3和C6等分子在咽鳃裂、肝盲囊、消化道和卵巢等组织表达水平较高，说明这些分子均可能与免疫反应相关。GST pull-down实验证明AmphiC1q1能与MASP相互作用，并且这种结合不需要Ca2+的参与，推测AmphiC1q1参与补体系统的凝集素途径。C3和C6与细菌的结合实验表明它们与大部分细菌有结合作用，具体的机制还不是很清楚。经过抗菌筛选，并未发现文昌鱼补体系统的杀菌作用，攻膜复合体的存在与否有待进一步的实验去验证。