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目的:
观察连续性血液净化(CBP)对严重脓毒症患者Toll样受体及炎症介质的影响,并探讨其对脓毒症可能的治疗机制。
方法:
30例严重脓毒症患者随机分入常规治疗组和CBP治疗组,每组各15例。另选15名健康志愿者做为正常对照组。常规治疗指原发病的治疗、抗生素、血管活性药物、营养对症支持治疗、维持水电解质酸碱平衡及机械通气等治疗；CBP治疗指在常规治疗的基础上联合CBP治疗,选择高通量血液滤过(HVHF)模式,置换量设为4 L/h。两治疗组在治疗前及治疗24小时、48小时、72小时,取血液样本,流式细胞术(FCM)检测外周血单个核细胞(PBMC)表面Toll样受体-2(TLR2)和Toll样受体-4(TLR4)的蛋白表达,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测血清炎症介质肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)的浓度。并于治疗前及治疗第2、5、8天记录患者的急性生理和慢性健康状况(APACHE)Ⅱ评分。
半定量RT-PCR法检测外周血单个核细胞TLR2/4mRNA表达的变化:密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,以Trizol提取液提取外周血单个核细胞总RNA,用半定量RT-PCR法检测外周血单个核细胞TLR2/4mRNA表达的变化。
流式细胞术检测外周血单个核细胞表面TLR2/4蛋白表达的变化:在各时间点,采血后立即分离PBMC,即刻上机检测。
ELISA法检测血清炎症介质TNF-α、IL-6、IL-10的浓度变化:在各时间点采集外周血,离心、分离血清后,-80℃保存待测。ELISA试剂盒由博士德公司提供,实验过程按说明书操作。
统计方法:使用SPSS10.0统计软件进行分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
结果:
1、严重脓毒症患者与正常对照组TLR2/4及炎症介质相比较:严重脓毒症患者TLR2/4的mRNA与蛋白表达以及TNF-α、IL-6、IL-10的浓度水平,均明显高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。TLR2/4的mRNA与蛋白表达之间具有正相关性。
2、两治疗组严重脓毒症患者间年龄、性别及APACHEⅡ评分无统计学意义(P>0.05)；两治疗组治疗前相比较,TLR2/4及TNF-α、IL-6、IL-10的浓度水平均无统计学意义(P>0.05)。
3、两治疗组治疗前后单个核细胞表面TLR2/4蛋白表达变化情况:常规治疗组TLR2/4蛋白表达随治疗时间的延长,呈缓慢下降趋势,直到治疗72h,其P值才<0.05,出现统计学意义；CBP治疗组TLR2/4蛋白表达随治疗时间的延长显著下降,各治疗期与治疗前相比,P值均<0.05,差异有统计学意义。CBP治疗组TLR2/4蛋白表达均低于同期常规治疗组,P值均<0.05,差异有统计学意义。
4、两治疗组治疗前后炎症介质浓度变化情况:常规治疗组TNF-α、IL-6、IL-10以及CBP治疗组IL-10的浓度,各治疗期与治疗前相比,P值均>0.05,差异无统计学意义；CBP治疗组TNF-α、IL-6的浓度,在治疗24 h时明显下降,与治疗前相比P<0.05,差异有统计学意义,此后维持在较高水平。与常规治疗组同期相比,CBP各治疗期TNF-α、IL-6均明显下降,P<0.05,差异有统计学意义:两治疗组同期IL-10的差异无统计学意义(P>0.05)。
5、两治疗组治疗前后APACHEⅡ评分比较:两治疗组均不同程度降低了患者的APACHEⅡ评分,CBP治疗组幅度更大,且从治疗后第5天起,与常规治疗组相比,P<0.05,差异具有统计学意义。
结论:
CBP通过下调TLR2/4的蛋白表达,抑制过于亢进的非特异性免疫反应；通过降低血清炎症介质的浓度,使促炎和抗炎反应达到相对平衡。这可能是CBP对脓毒症治疗作用的机制之一。