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背景慢性髓细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是一种累及多功能造血干细胞的恶性血液系统疾病。按照病程可将慢性粒细胞白血病可分为慢性期、加速期和急变期,大多数患者在确诊时处于慢性期。甲磺酸伊马替尼(Imatinib,IM)是临床上第一个用于治疗CML的酪氨酸激酶抑制剂(TKI),能恢复慢性粒细胞白血病患者正常造血和实现血液学、细胞遗传学和分子缓解。然而,尽管IM和第二代和第三代TKIs的疗效令人满意,但仍有一部分患者表现出不同程度的耐药性。研究表明细胞内的ROS水平处于高含量状态,可引起氧化应激损伤和基因组的不稳定,并最终可能导致耐药性的形成。自噬在血液肿瘤方面的作用也得到了证实。但二者在慢性髓细胞白血病耐药中的作用及相互关系,有待进一步探索。深入研究耐药的分子机制,寻找克服耐药的新靶点至关重要。目的本课题基于K562和IM耐药K562/G细胞株,进行了全蛋白质组学分析,以研究CML细胞中TKI耐药性相关的蛋白质。此外,我们将研究重点放在这些差异分子上,并通过生物信息学技术分析,试图对CML耐药性涉及的信号传导途径和潜在的上游机制有一个总体的了解。并进一步探讨ROS-自噬相互作用机制对慢粒耐药的影响。方法(1)选取慢性粒细胞白血病细胞株K562为研究对象,采用浓度梯度法诱导伊马替尼耐药细胞株K562/G。(2)不同浓度伊马替尼作用于K562和K562/G细胞株后,利用CCK-8法检测两种细胞株细胞增殖抑制率,检测两种细胞株对伊马替尼的IC50值,计算耐药倍数。(3)收集细胞提取蛋白,通过将TMT标记、高效液相色谱分级技术以及基于质谱的定量蛋白质组学技术等一系列前沿技术的有机结合,对样本进行定量蛋白组的研究。(4)通过GO富集将鉴定到的差异蛋白(以差异倍数值变化超过1.5倍作为显著上调、小于1/1.5作为显著下调的变化标准,)分为3个一级大类:生物进程(Biological Process),细胞组成(Cellular Component)和分子功能(Molecular Function),从不同角度阐释差异蛋白的生物学作用。(5)我们使用wolfpsort软件对于差异表达蛋白进行了亚细胞结构的预测和分类统计。(6)为了阐明分子间代谢途径、复合物和生化反应之间的相互作用,进行了KEGG富集,并分析参与耐药相关的主要通路。(7)将差异蛋白中有关氧化还原平衡及自噬相关的蛋白进行富集分析。(8)采用通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测CML细胞株K562以及IM耐药细胞株K562/G中的自噬相关蛋白(Atg7,Atg8,Atg12,Beclin1,P62)及氧化相关蛋白(GSTM3,GSTM2,MGST1,ALDH2,IDH2,GSTP1,GSTO1,ALDH1A1等)的mRNA表达水平。(9)通过预实验确定伊马替尼工作浓度采用Western blot方法检测CML细胞株K562以及IM耐药细胞株K562/G及其在5.0μmol/L伊马替尼处理后不同时间(0h,4h,8h,16h,24h)后P62,LC3,c-PARP,β-Actin蛋白水平。(10)流式细胞仪检测K562及K562/G细胞中的活性氧(ROS)水平。(11)通过预实验确定K562/G中ROS抑制剂NAC工作浓度和作用时间,采用Western blot方法检测NAC及IM对自噬相关蛋白P62,LC3-Ⅱ水平的影响。(12)通过预实验确定K562/G中自噬抑制剂氯喹(CQ)工作浓度和作用时间,采用Western blot方法检测CQ及IM对P62,LC3,c-PARP蛋白水平的影响。(13)流式细胞仪检测K562/G在IM及CQ处理24h后ROS水平及细胞凋亡水平。(14)采用Western blot方法检测IM处理相应时间后细胞周期相关蛋白表达变化。结果1.蛋白质组学部分(1)在本项目实验中,共有5732个蛋白质被鉴定到,其中4990个蛋白质具有定量信息,以差异倍数值变化超过1.5倍作为显著上调、小于1/1.5作为显著下调的变化标准。与K562相比,K562/G中有149个蛋白质上调,277个蛋白质下调。(2)GO富集揭示了蛋白质组学差异表达的蛋白质主要涉及跨膜受体、氧转运体和谷胱甘肽转移酶的活性,在髓系白细胞活化、免疫应答和调节胞吐中发挥重要作用。其中一些蛋白质是质膜的固有结构成分。进行亚细胞结构定位分析,发现在各种亚细胞结构中,差异蛋白主要定位于细胞质,细胞核,细胞膜。(3)通过KEGG富集分析发现在两个细胞系之间差异表达的蛋白质主要涉及7条通路。其中谷胱甘肽(GSH)代谢和坏死通路明显富集。而上述两条途径与氧化还原平衡和自噬信号密切相关。通过筛选及富集分析我们发现,在这项研究中共有18个自噬相关蛋白质,如SQSTM(P62)和MAP1LC3B,以及28个参与氧化还原平衡和GSH代谢的蛋白质,包括ALDH2(乙醛脱氢酶2)、ALDH1A1(乙醛脱氢酶1)、GSTP1和GSTO1。2.细胞株基础实验部分(1)成功建立耐IM细胞株K562-G,并通过CCK-8法检测出两个细胞株的IC50值,K562-G细胞株耐IM程度较亲代细胞株K562多达50倍。未经IM处理的K562和K562/G细胞生长曲线基本相似。IM作用不同时间后,K562细胞与其耐药细胞株K562-G的细胞凋亡水平表现出明显差异(P<0.05),其中K562-G细胞株的细胞凋亡水平明显下降。(2)qRT-PCR结果表明,K562/G细胞中ATG7、Beclin 1、GSTP1、GSTO1、ALDH1A1和RFK的mRNA水平显著升高(P<0.05),而GSTM3、GSTM2、MGST1、ALDH2、IDH2和PRDX2的mRNA水平显著降低(P<0.05)。(3)用Western blot分析K562和K562/G细胞的自噬信号。与K562相比,K562/G细胞的LC3-Ⅱ升高,p62降低,表明K562/G细胞具有更高的基础自噬水平。当用5.0μmol/L的伊马替尼处理K562时细胞时,可以观察到LC3-Ⅱ信号的时间依赖性增加和p62的时间依赖性降低。随后,在K562/G细胞中也发现了类似的结果。K562/G细胞的自噬激活似乎比K562细胞更强、更早。而K562/G细胞在24小时才检测到c-PARP,明显晚于K562细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。流式细胞仪分析显示K562/G细胞的ROS也高于K562细胞(P<0.05)。(4)采用ROS的特异性猝灭剂NAC处理K562/G,发现经5mmol NAC预处理后,K562/G细胞中p62升高,LC3-Ⅱ降低(P<0.05)。采用自噬抑制剂10.0μmol/L CQ及5.0μmol/L IM处理K562/G细胞。无论是否加入IM,CQ都能抑制K562/G细胞自噬的激活,并且能促进c-PARP的产生。(5)当K562/G细胞用10.0μmol/L CQ预处理时,ROS水平显著升高,IM也能升高K562/G中ROS水平。此外,当CQ和IM分别作用K562/G 24h时,流式细胞术分析显示无论早期还是晚期,细胞凋亡均明显增加(P<0.05)。(6)与K562相比,K562/G的PHGDH、CDK4(Cyclin依赖激酶4)、CDK6(Cyclin依赖激酶6)、cyclin D1、p-Rb、p-p38和p-ERK1/2等相关标志物的表达水平较高,两株细胞在细胞周期调控方面存在明显差异(P<0.05)。结论慢性粒细胞白血病耐药细胞中自噬激活及ROS水平比K562细胞更高。抑制细胞自噬后,ROS水平升高,而抑制ROS后自噬水平反而下降,自噬和ROS之间相互影响形成负反馈环影响细胞的凋亡水平及细胞周期,进而影响细胞耐药。ROS-自噬反馈环的研究为慢性粒细胞白血病IM耐药提供新思路,为探索多靶点治疗提供科学依据。