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目的：树突状细胞(DC)和HepS肝癌细胞荷载α-半乳糖神经酰胺(α-GalCer)作为自然杀伤T细胞(NKT)刺激物,测量小鼠HcpS肝癌移植瘤模型肿瘤体积变化,记录小鼠生存期,检测脾细胞中NKT细胞活化程度及脾细胞杀伤活性,并观察注药后移植瘤组织凋亡、NKT细胞浸润情况及肿瘤细胞促血管生成因子表达的变化,分析活化后的NKT对小鼠Hcps肝癌移植瘤组织的作用机制,为α-GalCer活化的NKT和α-GalCer用于肝癌治疗的可能性及安全性提供理论依据。
方法：诱导扩增昆明小鼠骨髓来源的DC,体外DC细胞荷载α-GalCer,Heps肿瘤细胞荷载α-GalCer。随机取56只8周龄雄性昆明小鼠,接种Heps肝癌细胞于其背侧皮下,建立Heps肝癌移植瘤模型。将模型鼠随机分为4组(每组14只):①NS对照组,尾静脉注射与下同体积的NS;②DC组,尾静脉注射DC细胞4×106;③HepS荷载α-GalCer组,尾静脉注射HepS细胞荷载α-Gaiter4×106;④DC荷载α-GalCer组,尾静脉注射DC细胞荷载α-GalCer4×106。其中,每组各有6只单独用于观察生存期。(1)自注射日起,隔日测量各组小鼠肿瘤长、短径,计算注射后10d、20d及30d时肿瘤体积。(2)记录注射当天开始至小鼠死亡的时间,计算各组小鼠平均生存时间。(3)于注射后20d,各组分别处死5只小鼠。取肿瘤组织,石蜡包埋并切片,苏木素-伊红(HE)染色后光学显微镜观察。(4)于第20天取小鼠脾脏制成脾细胞悬液,用流式细胞术(FCM)检测NKT细胞比例。(5)于第20天取小鼠脾脏制成脾细胞悬液,以小鼠Heps肝癌细胞为靶细胞,乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测小鼠脾细胞细胞毒活性。(6)于第20天取各组小鼠肿瘤组织,用FCM检测肿瘤淋巴细胞中NKT细胞含量。(7)取各组小鼠肿瘤组织切片,分别应用Bcl-2抗体、Bax抗体和血管内皮生长因子(VEGF)抗体,行免疫组织化学染色。计数局部肿瘤组织中Bel-2阳性、Bax阳性细胞数量,并应用图像分析软件对肿瘤细胞VEGF表达强度进行半定量分析。
结果：
1.成功诱导扩增小鼠骨髓来源DC,体外Heps细胞荷载α-GalCer,DC荷载α-GalCer。
2.小鼠Heps肝癌腹水瘤细胞成功制备小鼠Heps肝癌移植瘤模型,成瘤率100％。
3.HopS荷载α-GalCer组及DC荷载α-GalCer组荷瘤小鼠移植瘤在注药后10d内增长缓慢,与NS对照组比较有显著差异;注药30d后,HepS荷载α-GalCer组及DC荷载α-GalCer组肿瘤体积明显小于NS对照组和DC组。
4.注药后58天时,HepS荷载α-GalCer组及DC荷载α-GalCer组仍各有2只荷瘤小鼠存活,生存期明显延长,与DC组、NS对照组相比差异有显著性。
5.各组小鼠肿瘤HE染色HepS荷载α-GalCer组及DC荷载α-GalCer组肿瘤细胞形态消失,坏死明显,组织中炎性细胞浸润明显,血管较NS对照组及DC组少。
6.各组小鼠脾细胞中NKT细胞的含量NS对照组、HepS荷载α-GalCer组、DC荷载α-GalCer组与DC组相比,NKT细胞含量增多,差异有显著性。
7.各组小鼠脾细胞的细胞毒活性效靶比为5:1、10:1及20:1时,DC组、HepS荷载α-GalCer组及DC荷载α-GalCer组脾细胞杀伤活性明显高于NS对照组。
8.各组小鼠肿瘤组织中NKT细胞的含量与NS对照组和DC组相比,HepS荷载α-GalCer组及DC荷载α-GalCer组NKT细胞浸润较多,差异有显著性。
9.各组小鼠肿瘤Bcl-2-IHC染色:注射后20d,HepS荷载α-GalCer组及DC荷载α-GalCer组Bcl-2蛋白表达明显低于NS对照组及DC组。
10.各组小鼠肿瘤Bax-IHC染色:注射后20d,HepS荷载α-GalCer组及DC荷载α-GalCer组Bax蛋白表达明显高于NS对照组及DC组。
11.各组小鼠肿瘤VEGF-IHC染色:注射后20d,HepS荷载α-GalCer组及DC荷载α-GalCer组VEGF表达明显低于NS对照组及DC组。
12.细胞免疫治疗的副反应注药后30d,NS对照组小鼠死亡3只,DC组死亡1只,HepS荷载α-GalCer组及DC荷载α-GalCer组小鼠活动良好,未见特殊不良反应,无一例死亡。
结论：
1.成功制备小鼠骨髓来源DC。
2.DC和Heps细胞荷载α-GalCer可以有效活化脾细胞中及Heps肝癌移植瘤中浸润NKT细胞。
3.DC和Heps细胞荷载α-GalCer活化的NKT减少Bcl-2及VEGF的表达,上调Bax的表达。