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本研究在分别构建了表达人膜反应性溶解抑制物(CD59)基因的重组载体pEGFPN1-CD59、表达人膜辅蛋白(MCP)基因的重组载体pEGFPN1-MCP后,利用精子介导法生产转CD59和MCP双基因小鼠,并采用PCR检测其结果。利用PCR、心脏灌注和RT-PCR检测转基因小鼠与非转基因小鼠交配后所生的后代。此外,还利用精子介导法生产转pcDNA3-CD59、pcDNA3-MCP双基因猪,所得结果如下:
1.将pcDNA3-CD59、pcDNA3-MCP质粒分别用限制性内切酶EcoRⅠ和KpnⅠ酶切,获得的目的片断与线性化的pEGFPN1质粒连接,成功构建重组载体pEGFPN1-CD59、pEGFPN1-MCP。
2.将分别含CD59基因和MCP基因的表达载体与脂质体混合制成基因-脂质体复合物,分别采用睾丸注射、输精管注射和精子/基因-脂质体复合物共孵育三种方法生产转双基因小鼠。其中睾丸注射法、输精管注射法和外源基因/精子共孵育法分别各处理公鼠5只,7d后各配母鼠25只,结果分别冲出胚胎793枚、810枚和357枚,荧光显微镜下检测到荧光的分别有81枚胚胎(10.2%)、75枚胚胎(9.26%)和53枚胚胎(14.9%)。PCR检测得到的胚胎,发现表达绿色荧光蛋白的胚胎其PCR反应阳性率为100%,说明外源基因在胚胎发育早期可以表达。
3.利用构建成功的转CD59+MCP双基因小鼠与非转基因小鼠交配,PCR检测所生的后代(34只),发现CD59基因阳性的有14只(41.2%),MCP基因阳性的有12只(35.3%),CD59+MCP双基因阳性的有8只(23.5%)。通过用人血清灌注小鼠心脏,发现转基因小鼠心跳时间明显比非转基因小鼠心跳时间长,差异显著(P<0.05)。RT-PCR检测转基因的表达情况,发现在转基因小鼠的心脏组织中有CD59基因、MCP基因的表达。
4.将CD59和MCP基因与脂质体混合制成基因-脂质体复合物,分别采用睾丸注射、输精管注射和精子/基因-脂质体复合物共孵育三种方法来生产转双基因猪。其中睾丸注射法处理公猪1头,44d后配母猪8头,7头受孕,产仔73头,结果检测到PCR阳性猪3头(阳性率4.3%);输精管注射法处理公猪3头,8d后配母猪3头,0头受孕;外源基因/精子共孵育法处理公猪4头,处理母猪4头,1头受孕,产仔11头,结果检测到PCR阳性猪1头(阳性率9%)。从15头受孕母猪共获得84只仔猪,经PCR初步检测,其中4只仔猪为转基因阳性,阳性率(4.8%)。