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柑橘大实蝇Bactrocera(Tetradacus)minax(Enderlein)是柑橘类水果的重要害虫之一,属双翅目、实蝇科、果实蝇属。滞育是昆虫特定发育时期发育停滞,新陈代谢降低以抵御周期性的高温、低温、干旱和食物缺乏等不良环境的一种生理现象,以此来保证昆虫种群和个体的生存。海藻糖作为昆虫的血糖,在昆虫生长发育和滞育方面起着重要作用。本研究通过对柑橘大实蝇海藻糖合成酶(TPS)、6-磷酸海藻糖磷酸酯酶(TPP)和海藻糖酶(Tre)的分子特性和功能展开了深入的研究,旨在为进一步弄清柑橘大实蝇滞育分子机制提供理论依据。主要研究结果如下:1.柑橘大实蝇呼吸速率的测定对柑橘大实蝇整个蛹期的呼吸速率进行测定,获得了柑橘大实蝇蛹期呼吸速率曲线,直接证明了柑橘大实蝇蛹滞育的发生。根据呼吸速率曲线把柑橘大实蝇蛹期划分为五个时期,即滞育准备期(PreD)、滞育早(ED)、中(MD)、后(LD)期以及滞育结束后发育期(PD)。此外,对20E注射蛹的呼吸速率进行测定,结果显示20E可以打破柑橘大实蝇蛹的滞育。2.柑橘大实蝇不同滞育期基因表达谱分析利用高通量测序技术对滞育准备期(PreD)、滞育早(ED)、中(MD)、后(LD)期以及滞育结束后发育期(PD)等五个点收集的柑橘大实蝇蛹进行表达谱测序。在十对两两比对的表达谱中,总共有4,808条基因显著上调或下调,这些基因主要与新陈代谢、信号转导、内分泌系统和消化系统有关。利用qPCR技术对表达谱的准确性进行了验证,结果表明随机挑选基因的qPCR检测结果与柑橘大实蝇数字基因表达谱测序结果呈现高度的相关性(皮尔逊相关系数=0.9534),说明柑橘大实蝇不同蛹期数字基因表达谱测序结果可信。此外,处于滞育维持期的滞育早(ED)、中(MD)、后(LD)期的样本在两两比较的表达谱中变化差异不大。3.柑橘大实蝇海藻糖代谢相关基因克隆及序列分析克隆获得了柑橘大实蝇5条海藻糖代谢相关酶基因cDNA全长序列,分别命名为BmTPS、BmTPPB、BmTPPC-1、BmTPPC-2和BmTre-1。BmTPS开放阅读框2,445 bp,编码814个氨基酸残基。BmTPPB、BmTPPC-1、BmTPPC-2的cDNA开放阅读框分别为825 bp、822 bp、822 bp,分别编码274、273、273个氨基酸。BmTre-1的c DNA序列开放阅读框为1,665 bp,编码554个氨基酸。预测BmTPS、BmTPPB、BmTPPC-1、BmTPPC-2和BmTre-1蛋白质分子量分别为92.05 kDa、31.27 kDa、30.42 kDa、30.85 kDa和63.78 kDa,等电点分别为6.05、7.10、5.63、5.24和5.15。使用邻位相连法构建系统发育树,BmTPS基因与所有双翅目昆虫TPS聚为一类,BmTre-1聚入Tre-1类别。4.柑橘大实蝇海藻糖代谢相关基因表达模式、酶活力及糖含量分析利用RT-qPCR技术对柑橘大实蝇海藻糖代谢相关基因在不同发育阶段的的表达模式进行了解析。BmTPS和BmTre-1的表达模式呈相反的趋势,BmTre-1在整个蛹期表达量较低,而BmTPS在整个蛹期表达量较高。此外BmTPPB、BmTPPC-1和BmTPPC-2基因三者之间的表达模式有细微的差别。对海藻糖合成酶(TPS)、6-磷酸海藻糖磷酸酯酶(TPP)和海藻糖酶(Tre)这三种海藻糖代谢相关酶在整个蛹期阶段的酶活力进行检测。结果显示,海藻糖合成酶(TPS)和6-磷酸海藻糖磷酸酯酶(TPP)呈现出相同的趋势,第60-120天的阶段维持高峰,而Tre酶活力却在60-120天时下降到最低。对柑橘大实蝇整个发育阶段海藻糖和葡萄糖含量进行了测定。结果显示,在柑橘大实蝇整个蛹期,其海藻糖含量都维持较高的水平,且波动不大。而葡萄糖含量则是从幼虫开始至整个蛹期均较低。对柑橘大实蝇1日蛹注射20E后,海藻糖合成酶(TPS)和6-磷酸海藻糖磷酸酯酶(TPP)在化蛹第30天时相较于对照组酶活力显著上升,而海藻糖酶(Tre)在化蛹第30天和第60天时酶活力相较于对照组则显著下降。此外注射20E后,海藻糖含量和葡萄糖含量在30日蛹时均显著下降。5.柑橘大实蝇RNA干扰技术的初步探究为了建立柑橘大实蝇RNA干扰体系,本研究将dsBmTPS注射到柑橘大实蝇三龄幼虫。结果表明,注射2.0或2.5μg dsBmTPS导致很高的沉默效率,其中注射2.0μg dsBmTPS作用效果最好,可以持续干扰72 h。BmTPS基因的成功干扰也导致了BmTPS酶活力和海藻糖含量的下降,此外也引起三条几丁质合成通路基因表达量下降,最终导致52%致死或畸形表型。此外,在柑橘大实蝇三龄幼虫注射20E引起了BmTPS基因和三条几丁质合成基因表达量上升,使得幼虫化蛹提前。