甘露醇发酵及甘露醇脱氢酶的克隆表达

• 作 者: 王芳
• 机 构: 河北科技大学
• 出 处: 河北科技大学
• 发表日期: 2009年期
• 关键词: 甘露醇 天然提取法 化学催化法 基因克隆 布氏乳杆菌

甘露醇，学名己六醇，是一种在食品、医药、化工等领域广泛应用的化工产品。目前国内甘露醇的生产方法主要有两种：天然提取法和化学催化法。化学催化法将果糖转化成甘露醇和山梨醇。而甘露醇脱氢酶（mannitol dehydrogenase MDH）将果糖转化为甘露醇没有副产物的生成，故而酶转化法将成为甘露醇生产的主要趋势。
已经报道了多种微生物具有产生甘露醇的能力，包括霉菌、酵母菌和细菌，其中细菌以乳杆菌属（Lactobacillus）、明串珠菌属（Leuconostoc）和酒球菌属（Oenococcus）为主要产生菌。
本实验以布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri CICC6007）为研究菌株，以葡萄糖、果糖为底物发酵产生甘露醇，从布氏乳杆菌中克隆到甘露醇脱氢酶基因，并在大肠杆菌中获得表达。
主要工作结果如下：
（1）改进了甘露醇及甘露醇脱氢酶的检测方法；
（2）研究了发酵培养基中碳源、氮源、维生素对甘露醇转化的影响，优化后的培养基组成为（1L）：蛋白胨5g、牛肉膏5g、酵母膏5g、柠檬酸二铵2g、NaAc2g、K2HPO42g、葡萄糖50g．果糖100g、MgSO450mg.MnSO450mg、 ZnSO450mg、吐温801mL、复合维生素1ml。
（3）研究了布氏乳杆菌CICC6007的生长规律，确立了主要工艺条件为：厌氧发酵，发酵初始pH6.3，发酵温度35℃，接种龄36h，接种量20％，发酵周期48h。经发酵甘露醇平均产量67.5g/L。
（4）通过PCR从布氏乳杆菌中克隆到甘露醇脱氢酶基因。该基因片段为1002bp，同短乳杆菌的甘露醇脱氢酶基因相似。通过基因序列比对表明该基因与肠膜明串珠菌和短乳杆菌的基因一致性分别为76％和73％。
（5）构建了克隆载体T—mdh和原核表达载体pET—mdh。经1mM IPTG的诱导，表达出了分子量为49KD的融合蛋白，粗酶活性11.6U/L。