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β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)广泛存在于动、植物和微生物中,在农业、食品、医药和化工领域行使多种多样的功能。它们可以去除糖类和糖苷化合物末端的非还原葡萄糖基;协助糖脂以及外源糖苷代谢;活化植物激素;释放芳香族化合物以及进行生物质转化。低聚半乳糖是一种由乳糖衍生的非消化性低聚糖,具有明显的益生元特性,作为人乳寡糖的替代品被广泛应用于婴幼儿奶粉中。截止目前,低聚半乳糖主要依靠酶法生产,糖苷水解酶以乳糖作为底物,生成不同聚合度的产物。低聚半乳糖未来的发展方向旨在发掘更加高效的催化剂以及获得纯度更高的产物。在本文以来源于嗜热细菌Thermotoga naphthophila RUK10的β-葡萄糖苷酶TN0602为研究对象,通过文献检索选取该酶活性中心以及催化口袋附近的氨基酸残基进行定点突变。以重组质粒p ET 28b-tn0602为模板,应用全质粒PCR的方法获得含有突变位点的重组质粒,使用T4多聚核苷酸激酶磷酸化PCR产物后进行连接,转入E.coli DH5α,培养后提取质粒并测序鉴定,最终以E.coli BL21(DE3)为表达菌,克隆表达了11个突变体蛋白。优化表达条件后,大规模表达突变体蛋白,经过热处理初步纯化并且冻干成蛋白粉后,即可用于催化合成低聚半乳糖。我们测定了突变体的水解和转糖苷活性,以及突变体对酶活性和产物组成方面的影响。研究发现,将414位苯丙氨酸突变为丝氨酸的突变体(F414S)通过抑制水解活性增加了低聚半乳糖的总产量(207.63 m M),乳糖初始浓度升高至1169 m M,产量升高4.79倍。F414S的最适反应温度为75°C,40 h后反应趋于平稳,产率提高至82.29%(野生型:65.77%),并且在GOS3的基础上合成了糖链更长的GOS4。以纤维二糖为底物时,30 h后反应达到平衡(GOS3:127.43m M,GOS4:1.2 m M)。重组表达后的突变体F414S带有组氨酸标签,经过Ni2+-IDA纯化后得到了电泳纯的蛋白,对其酶学性质进行了表征。突变体F414S水解对硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷(p NPGlu)和邻硝基苯酚-β-D-半乳糖苷(o NPGal)最适反应温度均高于95°C,最适反应p H分别为7.0和7.5。热稳定性研究显示F414S(0.2 mg/m L)在75、80和85°C下的半衰期分别为55、12.5和6 h。p H稳定性结果显示,F414S在p H 4.5-7.5的范围内具有较好的稳定性。动力学常数显示,F414S对底物的催化效率明显下降。本研究不仅为工业上更高效的生产低聚半乳糖提供了新思路,而且得到了催化性能更优秀的β-葡萄糖苷酶,可以为日后的研究打下基础。