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目的:本实验运用细胞学、细胞生物学、分子生物学、裸鼠移植瘤实验等技术手段,通过熊果酸对裸鼠体内胃癌移植瘤的干预实验及体外胃癌细胞MGC-803干预实验,从细胞水平及分子水平探讨熊果酸对体内、外胃癌细胞凋亡及自噬性死亡的影响,分析凋亡及自噬性死亡的发生机制,为熊果酸抗胃癌的治疗提供丰富的实验依据,为胃癌的中医药治疗提供理论支持。材料与方法:1.熊果酸干预PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导胃癌移植瘤细胞凋亡及自噬性死亡第一部分实验选取雄性BALB/c裸鼠为研究动物,建立人胃癌MGC-803细胞皮下移植瘤动物模型。实验动物分两组:模型组及熊果酸干预组。首先通过观察肿瘤,探明熊果酸具有抑制胃癌细胞增殖的作用。进一步通过免疫组织化学染色法及免疫印迹法检测凋亡相关蛋白Caspase 3、Caspase 9、Bax、Bcl-2表达情况,探明熊果酸具有诱导胃癌细胞凋亡的作用。检测自噬性死亡相关蛋白LC3、Beclin-1、P62表达情况,探明熊果酸具有诱导胃癌细胞自噬性死亡的作用。最后利用免疫组织化学法及免疫印迹法,阐明熊果酸通过干预PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制胃癌组织生长,抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡及自噬性死亡。2.熊果酸干预PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导胃癌细胞凋亡第二部分实验选取人胃癌细胞MGC-803进行培养,建立人胃癌细胞模型。首先通过倒置相差显微镜观察细胞数量变化与形态学改变明确细胞的生长状态,探明熊果酸具有抑制胃癌细胞生长的作用。利用CCK8法探明不同浓度熊果酸对胃癌细胞MGC-803生长的抑制作用。筛选组实验浓度分别为0、20、40、60、80（μmol/L）,时间分别为0、12、24、36、48、72（h）。筛选出熊果酸最佳药物作用浓度40μmol/L与时间48h。实验分为三组:对照组、40μmol/LUA干预组、40μmol/LUA+Z-VAD-FMK组。时间设定为48h。利用流式细胞术法检测各组细胞凋亡水平,探明熊果酸具有诱导胃癌细胞凋亡的作用。通过免疫印迹法检测凋亡相关蛋白Caspase 3、Caspase 9、Bax、Bcl-2表达情况,探明熊果酸具有诱导胃癌细胞凋亡的作用。通过免疫印迹法检测PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白PI3K、p-AKT、p-mTOR表达情况,阐明熊果酸干预PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导胃癌细胞MGC-803凋亡。3.熊果酸干预PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导胃癌细胞自噬性死亡第三部分实验选取人胃癌细胞MGC-803进行培养,建立人胃癌细胞模型。实验细胞分组:对照组,40μmol/LUA干预组、40μmol/LUA+3-MA组。时间设定为48h。首先通过MDC法制成玻片倒置荧光显微镜下观察细胞内绿色点状荧光信号表达的数量及强度变化情况,及利用双荧光m RFP-e GFP-LC3质粒转染细胞法,荧光显微镜下观察细胞内红色和绿色点状荧光的数量变化,探明熊果酸具有诱导胃癌细胞发生自噬性死亡的作用。利用免疫印迹法,观察各组细胞自噬性死亡相关蛋白LC3、Beclin-1、P62表达情况,探明熊果酸具有抑制胃癌细胞自噬性死亡的作用。最后利用免疫印迹法及免疫荧光细胞化学染色法检测PI3K、p-AKT、p-mTOR及ULK1蛋白表达情况,阐明熊果酸干预PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导胃癌细胞MGC-803自噬性死亡。结果:1.熊果酸干预PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导胃癌移植瘤细胞凋亡及自噬性死亡第一部分实验构建胃癌细胞MGC-803裸鼠皮下移植瘤模型成功。熊果酸对裸鼠胃癌移植瘤的生长具有明显抑制作用。与模型组相比,熊果酸干预组移植瘤体积明显减小,差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组相比,熊果酸干预组移植瘤质量明显减小,差异有统计学意义（P<0.05）。免疫组织化学染色法检测细胞增殖指数结果:与模型组相比,熊果酸干预组中PCNA蛋白表达减少。与模型组相比,熊果酸干预组中Ki67蛋白表达减少。免疫组织化学染色法检测凋亡相关蛋白表达结果:与模型组相比,熊果酸干预组中Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9蛋白表达增加,Bax蛋白表达增加,Bcl-2蛋白表达减少。免疫印迹法检测凋亡相关蛋白结果:与模型组相比,熊果酸干预组中Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9蛋白表达水平显著增加,Bax蛋白表达水平也显著增加,Bcl-2蛋白表达水平显著减少,差异有统计学意义（P<0.05）。免疫组织化学染色法检测自噬相关蛋白结果:与模型组相比,熊果酸干预组中LC3Ⅱ蛋白表达增加,Beclin-1蛋白表达增加,P62蛋白表达减少。免疫印迹法检测自噬相关蛋白表达结果:与模型组相比,熊果酸干预组中LC3Ⅱ蛋白表达水平显著增加,Beclin-1蛋白表达水平也显著增加,P62蛋白表达水平显著减少,差异有统计学意义（P<0.05）。免疫组织化学染色法检测PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达结果:与模型组相比,熊果酸干预组中PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达减少,ULK1蛋白表达增加。免疫印迹法检测PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达结果:与模型组相比,熊果酸干预组中PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平显著减少,ULK1蛋白表达水平显著增加,差异有统计学意义（P<0.05）。2.熊果酸干预PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导胃癌细胞凋亡倒置相差显微镜观察细胞生长状态结果:对照组胃癌细胞生长旺盛,呈上皮细胞样型,细胞大小不等,多角形或细长形,细胞轮廓清晰,细胞核较大,细胞间连接比较紧密。随着浓度增加,胃癌细胞数量减少。CCK8法检测结果:0-80μmol/L的熊果酸对胃癌细胞生长的抑制作用,随着熊果酸浓度的增加而增加。熊果酸具有抑制胃癌细胞生长的作用,并呈浓度和时间依赖性。熊果酸的最佳药物作用浓度是40μmol/L,最佳药物作用时间是48h。流式细胞术法检测细胞凋亡结果:与对照组比,40μmol/LUA干预组中细胞凋亡率显著增加,差异有统计学意义（P<0.05）。与40μmol/LUA干预组相比,40μmol/LUA+Z-VAD-FMK组中细胞凋亡率显著降低,差异有统计学意义（P<0.05）。流式细胞术法检测显示,凋亡抑制剂仅抑制熊果酸诱导部分胃癌细胞发生死亡,提示除凋亡外胃癌细胞仍存在其它死亡形式。免疫印迹法检测凋亡相关蛋白表达结果:与对照组相比,40μmol/LUA干预组中Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9蛋白表达水平显著增加,Bax蛋白表达水平也显著增加,Bcl-2蛋白表达水平显著减少,差异有统计学意义（P<0.05）。与40μmol/LUA干预组相比,40μmol/LUA+Z-VAD-FMK组中Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9蛋白表达水平显著减少,Bax蛋白表达水平也显著减少,Bcl-2蛋白表达水平显著增加,差异有统计学意义（P<0.05）。免疫印迹法检测PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达结果:与对照组相比,40μmol/LUA干预组中PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平显著减少,差异有统计学意义（P<0.05）。与40μmol/LUA干预组相比,40μmol/LUA+Z-VAD-FMK组中PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平显著增多,差异有统计学意义（P<0.05）。3.熊果酸干预PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导胃癌细胞MGC-803自噬性死亡采用MDC法检测细胞自噬性死亡结果:与对照组相比,40μmol/LUA干预组细胞内绿色点状荧光数量增多、强度增加。与40μmol/LUA干预组相比,40μmol/LUA+3-MA组细胞内绿色点状荧光数量减少、强度减弱。采用双荧光m RFP-e GFP-LC3质粒转染细胞法检测细胞自噬性死亡结果:与对照组相比,40μmol/LUA干预组中黄色和红色点状荧光数量均显著增加,差异有统计学意义（P<0.05）。与40μmol/LUA干预组相比,40μmol/LUA+3-MA组中黄色和红色点状荧光数量均显著减少,差异有统计学意义（P<0.05）。采用免疫印迹法检测自噬相关蛋白表达结果:与对照组相比,40μmol/LUA干预组中LC3Ⅱ蛋白表达水平显著增加,Beclin-1蛋白表达水平也显著增加,P62蛋白表达水平显著减少,差异有统计学意义（P<0.05）。与40μmol/LUA干预组相比,40μmol/LUA+3-MA组中LC3Ⅱ蛋白表达水平显著减少,Beclin-1蛋白表达水平也显著减少,P62蛋白表达水平显著增加,差异有统计学意义（P<0.05）。免疫印迹法检测PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达结果:与对照组相比,40μmol/LUA干预组中PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平显著减少,其下游ULK1蛋白表达水平显著增加,差异有统计学意义（P<0.05）。与40μmol/LUA干预组相比,40μmol/LUA+3-MA组中PI3K、p-AKT、p-mTOR、ULK1蛋白表达水平无显著差异,差异无统计学意义（P>0.05）。免疫荧光细胞化学染色方法检测各组细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达结果:与对照组相比,40μmol/LUA干预组中ULK1蛋白表达增加,PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达减少。与40μmol/LUA干预组相比,40μmol/LUA+3-MA组中PI3K、p-AKT、p-mTOR、ULK1蛋白表达情况无显著变化。结论:1.熊果酸具有抑制体内、外胃癌细胞生长的作用。2.熊果酸通过诱导胃癌细胞凋亡及自噬性死亡,从而抑制胃癌细胞生长。3.熊果酸诱导胃癌细胞凋亡及自噬性死亡,从而抑制胃癌细胞生长是通过干预PI3K/AKT/mTOR信号通路实现的。