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脂肪酶(EC3.1.1.3)又称羧酸酯酶，是一类可以在油水界面处水解长链脂肪酸甘油酯。在生物技术和合成化学中扮演着重要的角色，如脂肪水解、清洁剂、化学和制药工业等。尽管脂肪酶在有机相可以进行很多催化反应，但天然酶类包括脂肪酶一般在有机溶剂中都不稳定。因此开发天然耐有机溶剂脂肪酶在理论和工业应用上具有重要的意义。 本实验以10％DMSO、甲苯(V/V)等有机溶剂为筛选压力，从油污土样和污水等样品中筛选到耐有机溶剂极端微生物375株。经过初筛和复筛，得到一株耐有机溶剂产脂肪酶菌株ZS04，所产脂肪酶活力达到80U/mL，且ZS04脂肪酶对多种有机溶剂具有较高的耐受性。根据16S rDNA序列分析和Biolog微生物鉴定系统鉴定，该菌株被鉴定为Pseudomonas stutzer，命名为Pseudomonas stutzerZS04。初步优化了Pseudomonas stutzer ZS04培养60小时，酶活达到210 U/mL，比初始酶活(80 U/mL)提高了2.6倍。 采用SP-sepharose FF强阳离子交换层析一步纯化得到电泳纯的脂肪酶ZS04。纯化后该脂肪酶的比活力达到398.2 U/mg，纯化倍数为7.1倍，酶活回收率为15.1％。SDS-PAGE分析表该脂肪酶的表观分子量为29 kDa。 研究表明该脂肪酶最适反应pH为9.0，在较宽的pH范围内(7.5-11.0)具有较高的稳定性，最适反应温度为50℃，在30℃以下具有较好的热稳定性。金属离子Mg2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+等对脂肪酶ZS04活力有明显的激活作用。10mmol/L的Ca2+可以提高其热稳定性，60℃保温一小时酶活几乎不下降（对照下降为原来的40％）而Ni2+和Cr3+对脂肪酶ZS04有严重的抑制作用。 脂肪酶ZS04在25％(V/V)的各种亲水和疏水有机溶剂体系中均具有较好的耐受性。在十六烷、正辛烷、正己烷、正辛醇、乙醇、异丙醇、DMF和DMSO体系中处理1小时仍有较高的剩余活力，其中在DMSO中处理1d被激活1.7倍，显示该脂肪酶在有机相体系中的生物催化及药物中间体拆分中将有较好的应用前景。 根据脂肪酶水解片段的LC-MS/MS测序结果，克隆获得了脂肪酶ZS04的基因序列（全长936bp，编码311个氨基酸）。脂肪酶ZS04与Pseudomonas stutzeriA1501的脂肪酶氨基酸同源性为93％。并设计克隆了该脂肪酶的折叠酶，折叠酶为一段长度为1014bp，编码337个氨基酸;折叠酶ZS04与Pseudomonas stutzeriCCUG29243折叠酶的氨基酸同源性为85.4％。对脂肪酶ZS04与折叠酶ZS04进行了异源共表达，重组酶活力达到0.73U/mL，破碎上清活性电泳也显示出脂肪酶活力。初步验证了脂肪酶及其折叠酶的基因。 本实验将耐有机溶剂脂肪酶ZS04用于多种手性仲醇的拆分并优化了其中1-(4-甲氧基苯基)乙醇的拆分工艺条件。在正庚烷体系中，1-(4-甲氧基苯基)乙醇浓度300 mmol/L，月桂酸乙烯酯浓度1200mmol/L，酶粉用量30mg/4mL，50℃，180 r/min条件下，反应24 h，底物转化率达到50％，eep、ees为99.9％，对映体选择率E＞＞200。表明脂肪酶ZS04对1-(4-甲氧基苯基)乙醇具有优良的立体选择性。