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植物寄生线虫（Plant Parasitic Nematodes）是一种高度专化型的杂食性植物病原线虫,主要寄生在植物根部,几乎可以感染所有的作物并造成作物减产,据统计可造成全世界每年1500多亿美元的经济损失。在长期的防控植物寄生线虫的实践中,人们逐渐认识到生物防治有着其它防治措施难以比拟的优势,而生防细菌在防控植物寄生线虫实践中发挥着独特作用,因此基于生防细菌的生物防治技术的研究开发受到世界各国普遍重视。丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）MB03是本实验室从感病植物组织中分离到的一株病原细菌,前期工作已证实该菌对模式线虫秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）和主要的作物虫害线虫南方根结线虫（Meloidogyne incognita）均呈现杀虫活性。本研究通过序列比对确定了一种新型溶血素RTX家族的毒性因子PtxA,对该蛋白的杀虫活性、抑制线虫生长、运动、产卵和取食偏好等的性能和在线虫体内的作用部位进行了观测;对该蛋白的作用结构域进行了分析;然后对其在线虫体内的可能受体进行了初步筛选。所获得的主要研究结果如下:基于MB03菌株的基因组序列构建了该菌毒性蛋白与毒性因子的预测数据库。数据库显示MB03中共有200多个潜在的具有直接或辅助杀虫的酶类或毒性蛋白,主要种类包括有Rhs家族、几丁质酶类、胶原蛋白酶类及溶血素类蛋白等。通过VirulentPred网站进行辅助序列分析从数据库中确定一种新型溶血素RTX家族的毒性因子PtxA作为研究对象。将PtxA基因克隆到大肠杆菌（Escherichia coli）表达载体pET-28a上,并表达和纯化获得PtxA纯蛋白。纯化PtxA蛋白对秀丽隐杆线虫显示具有较强的毒性,测得LC50值为65.955（41.032125.246）μg/mL,线性回归方程（相关系数）为Y1=-4.493+2.47X1;对南方根结线虫的生测LC50为139.825（30.139264.375）μg/mL,线性回归方程（相关系数）为:Y2=-6.259+2.917X2,也呈现很强的毒性作用。对秀丽隐杆线虫L1期虫体生长抑制实验表明,PtxA蛋白具有很强的抑制生长作用,在315μg/mL作用浓度下,实验组线虫体长仅达到对照组线虫的50%。此外,PtxA蛋白能够抑制线虫产卵数,相同浓度下实验组线虫产卵数远低于对照组,在252μg/mL作用浓度下,实验组线虫平均产卵数仅为对照组的30%。取食偏好性实验表明相对重组菌来说线虫更偏向于取食含有空载的大肠杆菌。通过用绿色荧光标记秀丽隐杆线虫基因工程缺陷虫株FT63肠道和用FT63作为试虫,经PtxA作用3 d后,观察到实验组线虫竹节状荧光结构遭到部分破坏,而对照组则很完整,说明PtxA蛋白可对线虫肠道造成物理伤害。利用pDS3.0系统将ptxA基因敲除,比较PG平板上△PtxA和野生菌株MB03对秀丽隐杆线虫的毒性,结果展示了二者毒性有一定的差异,△PtxA菌株平板上线虫死亡率要小于野生菌株MB03。为验证PtxA蛋白两个预测结构域的功能,将各自编码基因片段分别克隆到表达载体上,构建大肠杆菌重组菌MB772和MB773,经表达后得到纯化蛋白DUF和M10C。利用秀丽隐杆线虫做试虫进行液体杀虫试验,结果显示两个截断的功能结构域片段均对线虫有一定的毒性,其中DUF蛋白的毒性强于M10C,但是两个截断结构域的蛋白毒性弱于全长结构域的蛋白毒性,反映出PtxA蛋白的毒性要靠两者协作才能完全发挥。将PtxA作为诱饵蛋白,通过酵母双杂交实验从秀丽隐杆线虫体内获取了20多个疑似受体蛋白,从中选取了rps9、rps25、daf-21和col-77等四个受体蛋白基因设计引物,以不同处理时间的线虫总RNA为模板,调查PtxA作用后不同时间线虫基因的表达量变化情况。结果显示相对于对照组来说,PtxA作用线虫12 h和24 h后,这4个基因表达量基本上都发生了下调,反映出PtxA蛋白影响了这些线虫基因的表达。