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研究背景与目的胃癌(Gastric cancer,GC)是现今严重威胁到人类生命与健康的主要恶性肿瘤之一,其发病机理至今仍未完全阐明,防治依然欠理想。当前,外科手术对于可切除的胃癌仍旧是唯一可治愈的方法。现代肿瘤分子生物学研究证明,肿瘤的发生、发展是一种基因性疾病,针对肿瘤驱动基因靶向治疗极具潜力,可望治愈肿瘤。而胃癌靶向治疗相对较为滞后。据2009年美国临床肿瘤学会(American Society of Clinical Oncology,ASCO)报道一项ToGA研究首次证实了靶向药物—曲妥珠单抗联合化疗一线治疗可改善人类表皮生长因子受体2(Human epidermal growth factor receptor-2,HER2)阳性晚期胃癌患者生存,但受益患者仅是小部分,故继续探索胃癌靶向治疗具有积极意义。贝伐单抗是一种人源化的血管内皮生长因子-A(Vascular Endothelial Growth Factor-A,VEGF-A)单克隆抗体,具有强大的抗血管生成效应,在结直肠癌、肺癌和肾细胞癌中发挥良好抗肿瘤作用,但其抗胃癌效果却未尽人意。究其原因部分学者们认为胃癌的增殖生长与侵袭转移主要依赖淋巴道和血道双重途径,同时阻断淋巴管生成和血管生成较单一干预抑制相应肿瘤增殖生长与侵袭转移应是控制肿瘤更为有效的策略,有潜在广阔的应用前景。因此,本课题观察利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术阻断人血管内皮生长因子-C(Vascular Endothelial Growth Factor-C,VEGF-C)表达联合靶向VEGF-A抑制剂-重组人源化单克隆抗体贝伐单抗对胃癌恶性生物学行为影响,拟为胃癌防治开辟新的策略。方法一、应用实时荧光定量PCR(Real Time quantitative PCR,RT-qPCR)技术检测正常胃上皮细胞株(GES-1)和胃癌细胞株(SGC7901、MGC803、BGC823)中VEGFA、VEGF-C mRNA表达水平,筛选出相对高表达VEGF-A mRNA和VEGF-C mRNA的胃癌细胞株作为靶胃癌细胞株用于后续实验。二、采用CCK-8增殖-毒性实验检测贝伐单抗对靶胃癌细胞株抑制率及IC50值;通过美国生物信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)查询VEGF-C mRNA序列,设计并合成3组VEGF-C-shRNA表达载体,分别将空载慢病毒载体及分别载有3组VEGF-C-shRNA的慢病毒载体转染至靶胃癌细胞株,Western Blot法检测、筛选对VEGF-C抑制效率最高的VEGF-C-shRNA序列,确定该VEGF-C-shRNA表达载体稳转靶胃癌细胞株用于下步实验。三、将未予任何处理靶胃癌细胞株设为空白对照组,转染空载慢病毒(Lentivirus,LV)载体的靶胃癌细胞株为空载对照组,贝伐单抗干预的靶胃癌细胞株为贝伐单抗干预组,VEGF-C-shRNA-LV干预的靶胃癌细胞株为沉默干预组,VEGF-C-shRNA-LV联合贝伐单抗干预的靶胃癌细胞株为联合干预组。运用CCK-8法、集落形成实验检测各实验组胃癌细胞增殖能力,流式细胞术检测诱导凋亡能力,Transwel侵袭实验、划痕实验分别检测胃癌细胞侵袭、迁移能力,并利用RTqPCR、Western Blot分别检测胃癌细胞VEGF-A、VEGF-C mRNA和蛋白表达。结果一、RT-qPCR检测结果显示,VEGF-A mRNA在胃癌细胞株SGC7901、MGC803、BGC823和正常胃上皮细胞GES-1中相对表达量分别为6.667±0.74、5.599±1.4、3.847±0.208和1.059±0.114;VEGF-C mRNA在以上细胞株中相对表达量分别为9.005±0.397、36.779±0.664、3.698±0.16和1.016±0.011。VEGF-A mRNA和VEGFC mRNA在3株胃癌细胞株SGC7901、MGC803、BGC823中表达较正常胃上皮细胞GES-1均明显升高(P<0.05)。选相对同时高表达VEGF-A mRNA和VEGF-C mRNA的胃癌细胞株SGC7901作为靶胃癌细胞株用于后续实验。二、CCK-8增殖-毒性实验结果显示,贝伐单抗对胃癌细胞株SGC7901抑制作用与药物浓度成正比,在贝伐单抗浓度为0、100、500、1000、2000和2500(ug/ml)作用48h后抑制率(%)分别为0、0.438±0.013、0.678±0.004、0.729±0.004、0.75±0.003和0.818±0.002。各药物浓度相较无药物干预对胃癌细胞株SGC7901抑制率有明显升高(P<0.05)。通过绘制抑制率折线图,计算50%抑制率对于药物作用浓度,即IC50值为48h-160ug/ml。利用Western Blot检测分别转染空载慢病毒和VEGF-CshRNA1-LV、VEGF-C-shRNA2-LV和VEGF-C-shRNA3-LV的胃癌细胞株SGC7901,VEGF-C蛋白相对表达量为1.002±0.003、0.783±0.007、0.885±0.065和0.423±0.014。shRNA1、shRNA3转染的胃癌细胞株SGC7901的VEGF-C蛋白表达减少(P<0.05,P<0.01),其中shRNA3对VEGF-C蛋白表达阻断效率最高,确定此组VEGF-CshRNA表达载体稳转胃癌细胞株SGC7901进入后续实验。三、CCK-8增殖实验、集落形成实验、流式细胞术检测凋亡、Transwell小室侵袭实验和划痕实验结果显示,空白对照组和空载对照组胃癌细胞株SGC7901增殖生长、凋亡、侵袭和迁移能力差别无统计学意义(P>0.05),与空白对照组、空载对照组、贝伐单抗干预组和沉默干预组比较,联合干预组细胞增殖生长、侵袭和迁移能力明显降低(P<0.05),诱导凋亡能力显著升高(P<0.05)。RT-qPCR、Western Blot检测结果显示,空白对照组和空载对照组胃癌细胞株SGC7901的VEGF-A、VEGFC的mRNA和蛋白表达差别无统计学意义(P>0.05),与空白对照组、空载对照组、贝伐单抗干预组和沉默干预组比较,联合干预组细胞VEGF-A、VEGF-C的mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论胃癌细胞VEGF-A、VEGF-C表达明显升高,而RNA干扰技术可有效阻断胃癌细胞SGC7901的VEGF-C表达,贝伐单抗能抑制胃癌细胞株SGC7901的活性,RNA干扰技术阻断VEGF-C表达联合靶向VEGR-A单克隆抗体贝伐单抗能应可同时抑制淋巴管与血管生成,从而更有效地抑制胃癌细胞株SGC7901增殖生长,强效诱导肿瘤细胞凋亡,并明显降低肿瘤细胞侵袭和迁移能力,为胃癌基础研究深入和临床新药开发提供新的靶点和治疗策略。