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Cullin-RING E3泛素连接酶(CRL)是目前已知最大的E3泛素连接酶家族,由四个亚单位组成:一个骨架蛋白cullin,一个衔接蛋白,一个底物识别亚基和一个RING蛋白。在真核细胞中,经蛋白酶体降解的蛋白有约20%是通过CRL介导的泛素化被降解。在泛素化过程中,CRL负责选择性识别和募集底物,并催化泛素从E2泛素耦联酶转移到底物的一个赖氨酸残基上。上述过程不断重复,在底物上形成多聚泛素化长链,最终诱导底物被蛋白酶体识别和降解。通过促进一些关键信号分子的降解,CRL在细胞周期调节、基因转录、信号转导、DNA复制及肿瘤发生发展等多种细胞生物学进程中起到重要作用。在许多人类癌症细胞中,已发现CRL的多种亚单位过表达,且与患者较差的预后相关。此外,已有研究发现在小鼠肿瘤模型中通过敲除过表达的CRL亚单位可显著抑制肿瘤生成。上述研究充分表明CRL是一个富有潜力的抗肿瘤靶点。CRL的活性依赖于拟素化(neddylation)修饰。拟素化同泛素化类似,是一个由三种酶级联催化完成的的酶促反应,可将一个类泛素蛋白拟素(NEDD8)连接到cullin家族蛋白C端的一个赖氨酸残基上。这三种酶分别是NEDD8激活酶(也称NEDD8 E1或NAE)、NEDD8耦连酶(包括UBE2F和UBE2M)和NEDD8 E3连接酶。因此,阻断cullin蛋白的拟素化可有效抑制CRL的泛素连接酶活性。实际上,MLN4924,一个特异性抑制NAE的的小分子抑制剂,已成为第一个进入多项临床II期研究的新型抗拟素化抗肿瘤药物。然而,由于MLN4924抑制NAE,阻断所有拟素化修饰,因而会产生不可控的细胞毒性。而靶向NEDD8 E3连接酶的小分子抑制剂,理论上具有更高的选择性和更低的细胞毒性。为了达到上述目的,本课题从体外CUL5拟素化反应出发,研发了基于Alpha Screen的高通量筛选模型,用于寻找靶向CRL5的小分子抑制剂。在包含近17000种FDA-认证药物、MRCT核心结构化合物和天然产物的预筛选中,发现了数种候选阳性化合物,并着重研究了醋酸棉酚,一种已知可抑制抗凋亡蛋白BCL2的天然产物。本研究发现醋酸棉酚可通过结合SAG-CUL5和RBX1-CUL1,阻断cullin蛋白拟素化。在多种肿瘤细胞中,醋酸棉酚均可选择性地积累CUL5底物NOXA和CUL1底物MCL1。将醋酸棉酚和MCL1抑制剂联用,可协同诱导肿瘤细胞发生凋亡,从而揭示了一种合理、有效的抗肿瘤药物联用方案。此外,在采用Chem Bridge公司22万余个化合物的大规模高通量筛选中,发现了数个可抑制cullin拟素化的不同结构的小分子化合物。通过构效关系研究(structure-activity relationship,SAR)发现了一个在体外试管和细胞系中均可选择性抑制CUL5拟素化的小分子抑制剂K310。机制上,K310可结合UBE2F-SAGCUL5复合物并降低其稳定性,阻断CUL5拟素化。后续研究将通过大量合成K310及其类似物,在生物化学、细胞生物学和动物移植瘤模型等水平展开深入研究,最终研发出一类可高选择性抑制CRL5、低毒性的新型抗肿瘤药物。