溃疡性结肠炎患者外周血调节性T细胞功能状态的研究

• 作 者: 刘香
• 出 处: 中国医科大学
• 发表日期: 2007年期
• 关键词: 溃疡性结肠炎 调节性T细胞 流式细胞 细胞因子

前言炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）是一组累及胃肠道的自身免疫性疾病，包括溃疡性结肠炎（uclerative colitis，UC）和Crohn病（Crohn’sdisease，CD）。近年来，炎症性肠病（IBD）尤其是溃疡性结肠炎的发病率呈逐年上升趋势。其病因、发病机制目前仍不明确，认为与免疫、环境、感染及遗传等多种因素相互作用有关，其中免疫因素在IBD发病中起着重要作用，且已成为研究热点。炎症性肠病由过强的免疫反应所介导，T淋巴细胞在其中起重要作用，但T胞介导的免疫失耐受机制不很清楚。机体内存在以抑制免疫反应为主要功能特点的较独立的CD4⁺T淋巴细胞亚群（现倾向于称为调节性T淋巴细胞，Treg），其中CD4⁺CD25⁺T细胞是目前所认识的最重要的一群，调节性T淋巴细胞／致病性T淋巴细胞平衡是机体调节免疫反应的重要模式之一，其紊乱可能是很多自身免疫性疾病的发病机制。过强的免疫反应可由致病性T细胞（促炎促免疫T细胞）原发性功能增强引起，也可能由调节性T细胞免疫抑制功能原发性下降所引起。研究调节性T细胞在病人机体内的功能状态，回答炎症性肠病的发病是否与调节性T淋巴细胞的抗原特异性免疫抑制功能缺陷有关是值得尝试的。从正常人和UC患者外周血中收集并分离淋巴细胞和单核细胞，用自体肠道菌群制作成抗原，在体外培养中刺激淋巴细胞，然后检测代表调节性T细胞的表型CD25、CD152、CD45RB（CD45RO），转录因子FOXP3，以及细胞因子IL-6、TNF-α、IL-10、IFN-γ和IL-4等，能够初步的评介出调节性T细胞的在UC中的数量及功能状态。材料与方法一、材料研究对象均来源于于中国医科大学盛京医院内镜中心做电子肠镜检查者。对照组15例，男8例，女7例，年龄20-57岁，平均36岁；溃疡性结肠炎（UC）组23例，男14例，女9例，年龄16-55岁，平均33岁。二、主要试剂及仪器Human Regulatory T Cell Staining Kit，CD4（7E14）-FITC／CD25（1TYV）-PECocktail，抗人CD45RO（UCHL1）／Biotin和CD152／Biotin，ELISA Kit，考马斯亮蓝总蛋白定量试剂等。流式细胞仪、低速低温离心机、CO₂孵箱、超声细胞破碎仪、酶标仪、可见光分光光度计等三、淋巴／单核细胞分离用肝素抗凝管采外周血10mL，10min内用RPMI1640（含10mmol／LHEPES，100kU／L青霉素、30mg／L庆大霉素）10mL稀释后加入2个15mL离心管，用连接6号加长针头的注射器抽Lympholyte-H（1．077 kg/L），每管4mL缓慢加在稀释血液下面，1200r／min离心20min，取灰白层单个核细胞悬液，PBS洗2次，用5mL RPMI1640（含100mL／L胎牛血清，HEPES及双抗）混悬细胞，将低密度Percoll（1．068kg/mL，335mmol／L）4mL和高密度Percoll（1．080 kg/mL，335mmol／L）2mL分层铺在细胞悬液下面，2000 r／min离心15min，取低密度Percoll中段以上及至高密度Percoll中段的细胞悬液，分别作为单核细胞和淋巴细胞，PBS洗2次，苔盼蓝染色计数活细胞均在96％以上，取细胞悬液作离心涂片，Wrights-Giemsa染色鉴定，淋巴细胞和单核细胞的纯度分别在97％和90％以上。四、肠道菌群抗原的制作肠镜下取大肠标本，将其表面所带细菌接种到50ml疱肉培养基中，液体石蜡封闭，37℃培养48小时，离心、超声破碎及考马斯亮蓝法测细菌抗原总蛋白浓度。五、细胞培养培养基为约含10％自身血浆的RPMI-1640，滤除去血小板，用含双抗（100μ／ml青霉素+30μg／ml庆大霉素）、10mM HEPES及0．05mMβ-ME的RPMI-1640稀释后作为完全培养基。单核细胞以1×10⁵个／孔加入96孔板，并以20μg／ml加入自身来源的肠道厌氧菌群抗原，对照孔不加细菌抗原，16小时后每隔2小时半量换液一次，共4次，以稀释除去细菌抗原，然后按8×10⁴／孔加入自身的淋巴细胞，隔天半量换液一次。六、流式细胞术分离第2天及混合培养第14天的淋巴细胞用于流式细胞检测CD4、CD25、CD45RO、CD152及FOXP3的表达，操作按照试剂盒说明。七、ELISA培养上清液中细胞因子IL-6、TNF-α、IL-10、IFN-γ和IL-4的浓度用ELISA检测，按照说明操作。八、统计分析所有数据均用Mean±SD表示，计算用SPSS11．5完成，比较采用独立样本的t检验，P<0．05和P<0．01被认为分别具有统计学意义和显著意。结果一、淋巴／单核细胞的分离效果及鉴定淋巴和单核细胞计数在96％以上，淋巴细胞的纯度为95％以上，单核细胞的纯度在85％以上，从12ml人外周血中分离出1．23±0．33×10⁷个淋巴细胞和1．76±0．71×10⁶个单核细胞。二、未刺激淋巴细胞CD4、CD25和FOXP3的表达外周血淋巴细胞CD4、CD25、CD25^hi、FOXP3的表达在对照组和溃疡性结肠炎组间无明显差别。约60％的CD25⁺细胞同时表达FOXP3，85％的CD25^hi细胞同时表达FOXP3。无论在对照组还是UC组，CD25^hi和FOXP3的表达具有非常显著的相关性（P<0．001）。三、未刺激淋巴细胞CD4、CD25、CD45RO、CD152的表达约91％的CD4⁺CD25⁺T细胞同时表达CD45RO，CD152在CD4⁺T细胞膜表面很少表达（约占1％）。对照组与UC组新鲜分离外周血淋巴细胞在CD45R0和CD152的表达上没有显著差别。四、淋巴细胞在体外培养中经自身肠道菌群抗原刺激后，细胞总数均增加（与未刺激比较，对照组和UC组分别平均增加21％和52％，均P<0．001）。CD4⁺T细胞的比例在对照组和UC组均明显上升（P<0．001），而FOXP3⁺、CD25⁺FOXP3⁺及CD25^hiFOXP3⁺T细胞的比例变化不大。值得注意的是，无论CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺T细胞占CD4⁺CD25⁺T细胞的比例，还是CD4⁺CD25^hiFOXP3⁺T细胞占CD4⁺CD25^hi T细胞的比例，在两组的所有研究对象中均呈下降趋势（均P<0．05）。五、溃疡性结肠炎组外周血淋巴细胞对自身肠道菌群抗原体外刺激的增殖比对照组高（P<0．001），CD25⁺或CD25^hiT细胞中FOXP3⁺细胞的比例在刺激后UC组明显低于对照组（40．18％vs52．3％或53．90％vs 77．85％，均P<0．001）。六、外周血淋巴细胞与自身肠道厌氧菌群抗原刺激的单核细胞混合培养后，由单核细胞表达的IL-6和TNF-α在UC组明显高于对照组（P<0．01）。讨论调节性T细胞（Treg）以调节自身T细胞反应为主要功能。CD4⁺CD25⁺Treg细胞是目前研究较为深入的调节性T细胞亚群，分为天然Treg（natural Treg）和获得性Treg（adaptive Treg）。天然CD4⁺CD25⁺Treg细胞由胸腺中T细胞发育而来，在正常人和小鼠的外周血和脾组织的T细胞中约占5％～10％，在维持机体免疫自稳，调控免疫应答方面起重要作用。CD4⁺CD25⁺Treg细胞固有的表达IL-2αR（CD25）、IL-2βR（CDl22）、CILA-4（CD152）、GITR及高水平的CD44和中／低水平的CD45RB，Foxp3（鼠类为Foxp3）／FOXP3（人类为FOXP3）是特异性表达在CD4⁺CD25⁺Treg细胞上。本研究发现：外周血中淋巴细胞CD4、CD25、CD25^hi、FOXP3的表达在对照组和溃疡性结肠炎组间无明显差别，表明IBD患者外周血中CD4⁺CD25⁺Treg保持了他们的抑制活性。约60％的CD25⁺T细胞同时表达FOXP3，85％的CD25^hi细胞同时表达FOXP3。无论在对照组还是UC组，CD25^hi和FOXP3的表达具有非常显著的相关性（P<0．001）。FOXP3被认为是CD4⁺CD25⁺Treg细胞的特异性分子标记物，对CD4⁺CD25⁺Treg发挥功能是必需的，是Treg发育的一个重要开关，并为从分子水平揭示CD4⁺CD25⁺Treg细胞的发育及功能提供了新的研究途径。CD45RO⁺细胞代表已经抗原刺激而分化的功能细胞，称为记忆性T细胞，为了探索CD4⁺CD25⁺Treg细胞与记忆性T细胞的关系，我们同时检测了CD4、CD25和CD45RO的表达。发现约91％的CD4⁺CD25⁺T细胞同时表达CD45RO，说明CD4⁺CD25⁺Treg细胞主要存在于记忆性T细胞池中，提示曾被接受过抗原刺激，其只占记忆性T细胞的1／5。活动期IBD患者肠粘膜记忆性T淋巴细胞的CD45RO⁺表达增加，而且肠粘膜淋巴细胞表达早期激活抗原增加，这说明IBD患者肠粘膜T淋巴细胞的活性增强，免疫反应性增强。CILA-4（CD152）是重要的负向协同刺激分子配体，参与免疫反应的负向调节，自然产生的CILA-4⁺（CD152）GITR⁺CD25⁺T细胞亚群对自身免疫性疾病有很强的抑制功能。我们的检测发现CD4⁺T细胞膜表面很少表达CD152（约占1％）。对照组与UC组新鲜分离外周血淋巴细胞在CD45R0和CD152的表达上没有显著差别。免疫反应异常是IBD主要发病机制之一。正常个体大部分肠黏膜T细胞的主要刺激源于正常菌群，正常菌群抗原穿透黏膜固有层并持续存在，便会引起炎症性肠病（IBD）。在无菌环境下，给小鼠回输缺少CD4⁺CD25⁺Treg细胞不会引起IBD的发生，由此可见CD4⁺CD25⁺Treg细胞主要抑制过度抗病原体免疫，从而抑制对宿主过度的免疫病理损伤。我们用自身肠道菌群制备成抗原，与自体淋巴细胞混合培养，发现所有研究对象的淋巴细胞在体外培养中，经自身肠道菌群抗原刺激后，细胞总数均增加，CD4⁺T细胞的比例在对照组和UC组均明显上升，而FOXP3⁺、CD25⁺FOXP3⁺及CD25^hiFOXP3⁺T细胞的比例变化不大，CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺T细胞占CD4⁺CD25⁺T细胞的比例及CD4⁺CD25^hiFOXP3⁺T细胞占CD4⁺CD25^hiT细胞的比例，在两组的所有研究对象中均呈下降趋势。CD25⁺或CD25^hiT细胞中FOXP3⁺细胞的比例在刺激后UC组明显低于对照组。提示活化增殖的细胞中主要是CD4⁺CD25⁺FOXP3^-反应性T细胞，而不是CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞，尤其明显见于溃疡性结肠炎组，说明UC的发病可能与调节性T细胞数量减少或功能障碍有关。肠抗原物质刺激和激活淋巴细胞和／或巨噬细胞，都能合成和分泌一些致炎介质，即促炎性细胞因子和抗炎性细胞因子，二者之间的平衡失调是IBD的另一个重要发病机制。促炎性细胞因子IL-6是炎症反应中重要细胞因子，主要参与T淋巴细胞和B淋巴细胞的激活。给严重免疫缺陷综合症小鼠注入IL-6R单克隆抗体，在输入CD45RB^highT细胞后，可以免得结肠炎；IL-6缺陷小鼠不易感染结肠炎。作为一种炎性蛋白，TNF-α在IBD发病中的作用是使炎性细胞聚集到局部炎症组织导致水肿，并参与肉芽组织形成。IBD患者肠道组织炎症与IL-1β、IL-6、TNF-α高表达相关。本研究中，由单核细胞表达的IL-6和TNF-α在UC组明显高于对照（P<0．01），作为Th1细胞标记的IFN-γ、Th2标记的IL-4及重要的免疫抑制性细胞因子IL-10只低度表达，说明UC发病与促炎和抑炎两类细胞因子的比例失衡有关，UC的肠道炎症反应部分是由IL-6和TNF-α介导的。结论1、外周血中淋巴细胞CD4、CD25、CD25^hi、FOXP3及CD45R0和CD152的表达上，在对照组和溃疡性结肠炎组组间无明显差别，UC患者外周血中CD4⁺CD25⁺Treg保持了他们的抑制活性。2、对照组和UC组外周血CD4⁺CD25⁺Treg细胞中，CD25^hi和FOXP3的表达具有非常显著的相关性，FOXP3是CD4⁺CD25⁺Treg细胞的特异性分子标记物，对CD4⁺CD25⁺Treg发挥功能是必需的，是Treg发育的一个重要开关。3、所有研究对象的淋巴细胞在体外培养中，经自身肠道菌群抗原刺激后，细胞总数均增加，活化增殖的细胞中主要是CD4⁺CD25⁺FOXP3反应性T细胞，而不是CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺调节性T细胞，尤其明显见于溃疡性结肠炎组，CD25⁺或CD25^hiT细胞中FOXP3⁺细胞的比例在刺激后UC组明显低于对照组。UC的发病可能与调节性T细胞分化不足或功能障碍有关。4、外周血淋巴细胞与自身肠道厌氧菌群抗原刺激的单核细胞混合培养后，由单核细胞表达的IL-6和TNF-α在UC组明显高于对照组，UC的肠道炎症反应部分是由IL-6和TNF-α介导的。