论文部分内容阅读
第一部分研究目的：观察大鼠骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells MSCs)的分离和培养，通过不同浓度的5-氮胞苷(5-aza-dC)诱导大鼠MSCs分化为心肌细胞的比较，确定合适的的诱导浓度。研究方法：抽取大鼠骨髓，采用贴壁培养法分离MSCs，进行培养、传代，在第4代MSCs中添加诱导剂5-氮胞苷(5-aza)对其进行诱导分化，其浓度分别为：0μmol／L、10μmol／L、30μmol／L，观察细胞形态学的变化，荧光免疫组织化学方法进行鉴定。研究结果：5-aza-dC作用24h后，随着时间的延长，加入终浓度为10μmol／L 5-aza-dC的大鼠MSCs，10d后细胞之间出现连接，排列方向渐趋一致，有肌管形成，部分细胞则死亡。诱导28d后，细胞变稀，周围伸出多个长的突起，细胞形态大小不一。而加入终浓度为30μmol／L 5-aza-dC的MSCs，在诱导后第5d，细胞则全部死亡。结论：大鼠MSCs体外在5-氮胞苷作用下可定向分化为心肌样细胞。第二部分研究目的：探讨5-氮胞苷(5-aza-dC)、肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor HGF)作为诱导剂，体外诱导人类胚胎干细胞(Human embryonic stem cell hESC)分化为心肌细胞的最佳诱导分化浓度。研究方法：1．将传代的hESC(PKU-1-1)接种到低粘附六孔板中进行悬浮培养形成拟胚体(Embryonic Bodies EBs)。7d后，分别将EBs接种到四孔板中贴壁培养，分别以5-aza-dC、HGF为分化诱导剂加入分化培养基中，组合成几种分化培养基，分别为无诱导物组；5-aza-dC组，其浓度分别为：2.5μmol／L、5μmol／L、10μmol／L、20μmol／L；HGF组，其浓度分别为：1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、30ng/ml。通过观察出现的自发搏动的EBs的数量，计算各组分化成功的EBs数。2．光镜动态观察细胞形态学的变化，荧光免疫组织化学，RT-PCR以及电镜方法对分化细胞进行鉴定。组间比较用方差分析及t检验，以p＜0.05，为差异有显著性，比较各组之间的分化比率。研究结果：1．5-aza-dC终浓度为0-10μmol／L时均能在体外诱导hESC向心肌细胞分化，2.5-5μmol／L为最佳诱导浓度。Troponin T及Connexin43的表达呈阳性，并可见清晰肌小节。RT-PCR检测MLC-2A、MLC-2V、hANP、β-Actin mRNA表达阳性。电镜下可见细胞内有肌节样结构。细胞分化率比较：2.5μmol／L、5μmol／L组之间无明显差异(p＞0.05)，均明显高于0μmol／L、10μmol／L(p＜0.05)，此外0μmol／L、10μmol／L组之间也没有明显差异(p＞0.05)。而20μmol／L组的细胞大部分出现死亡。2．HGF终浓度为1ng/ml、5ng/ml、10ng／ml、30ng／ml时均能在体外诱导hESC向心肌细胞分化，Troponin T及Connexin43的表达呈阳性，并可见清晰肌小节。RT-PCR检测MLC-2A、MLC-2V、hANP、NKx2.5、GATA-4、a-MHC、β-Actin mRNA表达阳性。细胞分化率比较：5ng／ml、10ng／ml组之间无明显差异(p＞0.05)，均明显高于1ng／ml、30ng／ml组(p＜0.05)。结论：5-aza-dC、HGF均能诱导人类胚胎干细胞向心肌细胞分化，2.5μmol／L-5μmol／L的5-aza-dC效果最理想；5ng／ml-10ng／ml的HGF为最佳浓度区间。