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能源危机以及化石能源过度使用带来的环境恶化和温室效应的加剧，使将废弃物处理和能源产生有机结合起来的生物制氢技术成为近年来国内外研究的热点。本论文围绕产氢微生物开展了两方面的研究：(1)[FeFe]氢酶基因的筛选与异源表达；(2)氢气产率不同的3株产气英膜梭菌突变体的比较蛋白质组学分析。
1．[FeFe]氢酶基因的筛选与异源表达
氢酶是微生物产氢代谢的关键酶之一，高活性氢酶的同源过表达或异源表达可以提高微生物的氢气产率；运用合成牛物学的方法构建高效的新的生物产氢途径也需要高活性氢酶。元基因组学方法，克服了克隆功能基因的传统方法对微生物培养的依赖性，为新型氢酶的筛选提供了新的途径。
首先，建立了[FeFe]氢酶的序列筛选方法，并对实验室构建的基于沼气发酵混合菌群总基因组的fosmid文库中[FeFe]氢酶基因进行序列筛选。根据己知的[FeFe]氢酶序列的保守区域设计简并引物，并利用几株梭菌的基因组验证了引物的特异性。在以整版混合fosmid质粒为模板筛选的200块384孔板中，85％的384孔板中都存在[FeFe]氢酶基因。从两块384孔板中定位到5个氢酶阳性克隆；序列分析显示皆为新的[FeFe]氢酶序列。对其中的fosmid3-A2进行全序列测定，得到该克隆插入片断包含的异源三聚体[FeFe]氢酶三个亚基的编码基因。根据利用上述简并引物扩增到的一株新分离的高产氢梭菌菌株3-9的[FeFe]氢酶基因690 bp片断的序列，利用genome walking方法获得了该氢酶基因全长序列。在大肠杆菌中重组表达的上述[FeFe]氢酶均得到活性氢酶。上述结果表明，所设计的简并引物可以有效地用于新分离和未培养微生物中未知[FeFe]氢酶基因的发掘；实验室构建的文库中蕴藏着丰富的[FeFe]氢酶资源。
随后，为了简化[FeFe]氢酶的异源表达程序，构建了[FeFe]氢酶成熟辅助基因组成型表达的重组大肠杆菌。通过将[FeFe]氢酶成熟的三个辅助基因hydE、hydF和hydG分别整合到自身氢酶已经失活的大肠杆菌BW2513-10基因组的丙酮酸甲酸脱氢酶基因、发酵型D-乳酸脱氢酶基因和乙醇脱氢酶基因位点上，得到[FeFe]氢酶成熟辅助基因组成型表达的重组大肠杆菌BW2513-13。PCR和RT-PCR分析表明三个辅助基因都整合至基因组的特定位点上，并能够在厌氧条件下正确转录。利用来源于几株梭菌和文库中[FeFe]氢酶基因验证了该重组菌的[FeFe]氢酶表达能力。上述几个[FeFe]氢酶的异源表达均得到活性的氢酶，表明利用同源重组整合至染色体特定部位的方法可以实现[FeFe]氢酶成熟辅助基因的组成型表达，这将大大简化[FeFe]氢酶在大肠杆菌中异源表达的程序，特别是需要表达大量氢酶基因的研究。该系统将为不同氢酶的活[FeFe]氢酶基因的筛选和产气荚膜梭菌突变体的比较蛋白质组学分析性筛选及在大肠杆菌中构建新的产氢代谢途径奠定基础。
2．氢气产率不同的3株产气荚膜梭菌突变体的比较
蛋白质组学分析与产氢竞争还原力的还原性代谢产物合成途径的敲除是提高微生物氢气产率另一项措施，但有时重组菌的产氢能力并没有提高。产气荚膜梭菌W12在发酵产氢过程中积累乙酸、丁酸和乳酸。为了提高该菌的氢气产率，依次敲除了与产氢代谢竞争还原力的乳酸和丁酸合成途径的关键酶L-L酸脱氢酶（ldh）和乙酰辅酶A乙酰基转移酶（atoB）的编码基因。发酵动力学研究表明，ldh的敲除使产气荚膜梭菌W13的氢气产率比W12提高了50%；而atoB和ldh的双敲除却使菌株W14的氢气产率比W12下降了34%，且发酵液中积累了与乙酸等摩尔数乙醇。为了解析导致三株产气荚膜梭菌突变体氢气产率显著差异的生物机制，对三株突变体进行了比较蛋白质组学分析。
二维电泳分析得到78个显著差异表达的蛋白质点，并通过质谱鉴定得到31个蛋白质。Ldh和AtoB分别从相应的凝胶上消失，表明两个基因已经失活。鉴定到的三株突变体中差异表达的蛋白质包括参与甘油还原性代谢（2个）、丁酸合成（5个）、糖代谢（5个）、蛋白质合成（5个）的蛋白质和12个其它的蛋白质；没有检测到乙醇合成途径相关蛋白质表达的变化。同W12和W13相比，虽然W14不再产生丁酸，5个丁酸合成途径相关的蛋白质在W14中显著上调。我们选择甘油代谢和丁酸合成相关的7个基因进行实时荧光定量PCR验证，得到了与蛋白质组学一致的结果。
发酵动力学和比较蛋白质组学数据都表明丁酸合成途径的阻断显著提高产气荚膜梭菌乙醇的产生，而氢气的产率显著降低；丁酸合成与产气荚膜梭菌的产氢代谢呈正相关。上述结果也表明比较蛋白质组学分析可以为微生物产氢的复杂调节机制的阐明提供有力的实验证据。