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周围神经损伤后需恢复其连续性、完整性,使近端发出的再生轴芽能通过损伤段重新与靶器官形成支配而完成神经再生和修复过程。若存在神经缺损,则必须寻找到合适的桥接物来承载近端再生轴芽的通过和成熟,否则神经功能丧失而遗留终身残疾。目前在临床上,当神经缺损较小时可通过近远端的游离或改道及关节屈曲等方法,利用神经本身的弹性适当延伸予以修复,但当缺损>2cm时,一般便考虑应用移植材料桥接的方法。然而,尽管自体神经移植目前仍在临床使用,并认为足可靠的,但对粗大的、长段的神经主干缺损,体内无法获取相当的用于移植修复的其他神经材料,即便足切取小段的非主干皮神经用于修复它处主干神经的短距离缺损,也会出现供区神经瘤形成,遗留相应的功能障碍。
目前有学者采用可降解高分子材料,包括胶原、壳聚糖、海藻酸等[1,2],由于三维结构过于简单,无法复制类似天然神经的地貌学结构(Hadlock T2000,Evans GR2000,Fansa2001)。因此,找到既具有可降解高分子材料的优点,又能有利于三维构建,其结构具有更好的仿牛性的材料,则可能为临床修复神经长段缺损更佳选择。因此有必要探索更理想的神经支架材料。本课题组有20多年周围神经损伤与再生基础研究的经验,制备了去细胞同种异体神经,先后进行了大鼠和猕猴长段周围神经缺损的修复实验研究,获得了与自体神经修复结果相类似的令人振奋的结果[3-5]。
生物医用材料不应对人体组织、血液和免疫系统,产生毒性或有害作用[6-8]。本研究参照国际标准化组织GB/T16886.1-2001/ISO10993-1:1997医疗器械乍物学评价的标准和要求,对去细胞同种异体神经修复材料进行了细胞毒性试验、溶血试验、全身急性毒性试验、热原试验、皮肤刺激试验、致敏试验、遗传毒试验,以及按照国际机构制定的免疫毒性评价的指导原则进行了免疫毒理试验,评价了去细胞同种异体神经修复材料生物相容性的实验研究。
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实验1:细胞毒性试验。目的在离体状态下模拟生物体生长环境,评估去细胞同种异体神经修复材料接触机体组织后生物学反应。方法采用浸提液法与直接接触法在琼脂培养基平板环境中对小鼠成纤维细胞系L929的影响。结果去细胞同种异体神经修复材料浸提液对L929生长无影响,细胞毒性为1级。结论去细胞同种异体神经修复材料符合细胞毒标准。
实验2:溶血试验。目的评估去细胞同种异体神经修复材料对血液红细胞的溶血作用。方法将去细胞同种异体神经修复材料浸提液与新鲜兔血混合后,吸取上清液,读取吸光度,计算溶血率。结果同种异体神经生物材料浸提液的溶血率2.60％,小于5％。结论去细胞同种异体神经修复材料符合溶血标准。
实验3:全身急性毒性试验。目的评估去细胞同种异体神经修复材料浸提液被机体吸收并分布至靶器官或全身后所产生的损害作用,并进行毒性分级。方法小鼠尾静脉注射去细胞同种异体神经修复材料浸提液,注射后观察小鼠72h内的一般状态、毒性表现和死亡动物数。结果小鼠全身状况良好,未见毒性表现。结论去细胞同种异体神经修复材料符合全身急性毒性试验标准。
实验4:热原试验。目的评估去细胞同种异体神经修复材料是否释放热原物质。方法白兔耳静脉注入去细胞同种异体神经修复材料浸提液,观察兔体温升高的情况。结果体温的变化范围为-0.2至0.4℃,每只动物温度升高均小于0.6℃。总体升高在0.0和0.4℃之间。结论去细胞同种异体神经修复材料符合热原试验标准。
实验5:刺激试验。目的评估去细胞同种异体神经修复材料对小动物体的潜在刺激作用。方法采用斑贴法,去细胞同种异体神经修复材料浸提液对兔皮肤刺激作用,观察移去敷贴物后72h内接触部位的红斑及水肿情况。结果敷贴部皮肤均未见红斑、水肿等表现。结论去细胞同种异体神经修复材料符合刺激试验标准。
实验6:致敏试验。目的评估去细胞同种异体神经修复材料足否具有引发迟发型超敏反应的潜能。方法通过皮内注射诱导、斑贴激发的方式将去细胞同种异体神经修复材料浸提液作用于豚鼠,在规定的时间内观察豚鼠激发部位皮肤反应。结果注射部皮肤均未见红斑、水肿等表现。结论去细胞同种异体神经修复材料符合致敏试验标准。
实验7:遗传毒试验。目的评估去细胞同种异体神经修复材料产生遗传物质损失并导致遗传性改变的能力。方法采用Ames试验和骨髓微核试验,观察DNA和基因水平的变化。结果 Ames试验和骨髓微核试验中,去细胞同种异体神经修复材料组与阴性对照组比较均无显著性差异。结论去细胞同种异体神经修复材料符合遗传毒试验标准。
实验8:免疫毒理试验。目的评估去细胞同种异体神经修复材料对机体免疫系统产生的有害影响。方法与已临床应用的人工骨做比较,采用淋巴细胞增殖检测、血清抗体浓度检测、流式细胞术检测等实验,检测免疫原性。结果淋巴细胞增殖检测、血清抗体浓度检测未发现免疫原性,流式细胞术检测发现去细胞同种异体神经修复材料与已临床应用的人工骨低免疫原性相似。结论去细胞同种异体神经修复材料符合免疫毒性标准。