论文部分内容阅读
癌症严重威胁人类健康，抗肿瘤药物的研究与开发是当今医药研究领域的重要组成。虽然目前抗肿瘤药物的研究已取得了巨大进展，但在临床使用的过程中几乎所有的化疗药物都不可避免地会产生耐药，影响治疗效果。肿瘤耐药，尤其是肿瘤多药耐药是肿瘤治疗失败的主要原因之一，严重影响患者的生存质量和生存时间。因此，迫切需要开发新的抗肿瘤新药，特别是具有能够克服肿瘤多药耐药特性的抗肿瘤新药。天然来源的化合物是抗肿瘤药物的重要来源，这些化合物及其衍生物是肿瘤化疗领域中重要的组成部分。研究显示，丹参酮Ⅰ具有广谱的抗肿瘤活性和良好的抗多药耐药作用，目前对其抗肿瘤机制的研究已取得了一定进展，但其活性弱、水溶性差的特点限制了对其抗肿瘤作用及机制的研究，其抗肿瘤作用靶点也还未阐明。 本研究以丹参酮Ⅰ为母体化合物进行结构修饰，获得140余个新衍生物并开展抗肿瘤作用筛选。其中，代表性化合物S222及S439的抗肿瘤活性、水溶性较丹参酮Ⅰ均显著增强。本课题以S222及S439为主要研究对象，对丹参酮Ⅰ及其衍生物的体内外抗肿瘤作用、作用靶点及作用机制进行研究。 本研究在已有研究工作基础上从体内外抗肿瘤活性、抗多药耐药作用、Stat3抑制作用、细胞迁移运动及内皮细胞管腔形成抑制作用等方面对丹参酮Ⅰ及其衍生物的抗肿瘤作用进行了系统性的研究。研究结果表明，S222及S439对多种组织来源的肿瘤细胞均具有杀伤作用，保持了母体化合物的广谱抗肿瘤特征，并且两个衍生物的抗肿瘤活性均提高了10倍以上（丹参酮Ⅰ的平均IC50为21.49μM，S222的平均IC50为1.79μM，S439的平均IC50为1.56μM，衍生物的抗肿瘤活性分别提高了12倍和14倍）。对衍生物的抗耐药作用研究显示，两个丹参酮Ⅰ新型衍生物均能杀伤多药耐药细胞KB/VCR、MCF7/ADR及K562/A02，程度与对相应亲本细胞的作用相当。S439的平均耐药系数为0.85，S222的平均耐药系数为1.68;S439抗耐药活性约是S222的两倍。前期的工作显示，丹参酮Ⅰ能够下调Stat3第705位的磷酸化(p-Y705-Stat3)，并且其下调p-Y705-Stat3与其抗耐药、抗血管生成作用有关。研究发现，相对于丹参酮Ⅰ，两个衍生物下调p-Y705-Stat3的能力明显增加，但S222下调p-Y705-Stat3的能力弱于S439;与此一致的是，S222抑制细胞迁移运动及抑制内皮细胞管腔形成的能力均弱于S439;但S222与S439的抗肿瘤活性相当。由此提示，丹参酮Ⅰ及其衍生物下调p-Y705-Stat3的作用与其抗耐药、抗血管生成及抗转移作用相关;其对肿瘤细胞的杀伤作用，则还可能存在其它靶点及机制参与。此外，S222在HCT116细胞裸小鼠移植瘤模型中表现出良好的体内抗肿瘤活性，S439未在KB细胞体内移植瘤模型中显示出活性，可能与S439体内生物利用度、稳定性较低等原因有关。 对丹参酮Ⅰ及其衍生物作用靶点的研究发现，丹参酮Ⅰ及其两个衍生物均能够同时抑制DNA拓扑异构酶（topoisomerase）Ⅰ和Ⅱ（Top1和Top2），产生Top1/2-DNA可切割复合物(Top1/2-DNA cleavage complexes;Top1/2cc)，进而导致DNA双链断裂（标志物γH2AX）的蓄积。研究表明，相对于丹参酮Ⅰ，两个衍生物S222与S439引起Top1/2cc及γH2AX蓄积的能力显著增强，且S222及S439抑制Top1和Top2的能力强于羟基喜树碱（hydroxycamptothecin;HCPT）和依托泊苷（etoposide;VP-16）。另外，S222在亚精胺(spermidine;Spd)存在的体系中会引起质粒DNA条带拖尾，提示在生理条件下S222还可能直接与DNA作用，造成DNA损伤。 对丹参酮Ⅰ及其衍生物的作用机制研究发现，S439及丹参酮Ⅰ仅在p53功能正常的细胞中引起G2/M期阻滞，而不能引起p53突变或缺失的细胞发生明显的G2/M期阻滞;而S222能够引起不同p53背景的细胞发生G2/M期阻滞。细胞凋亡诱导研究结果显示，S439及丹参酮Ⅰ在无p53功能的细胞中具有更强的凋亡诱导能力，而S222不存在这种差异。此结果提示，S439及丹参酮Ⅰ可能对p53非依赖的DNA损伤应答通路产生影响，S439及丹参酮Ⅰ存在Top以外的作用靶点，但还有待进一步确证。 综上所述，本研究对以丹参酮Ⅰ为母体化合物修饰获得的衍生物进行了抗肿瘤作用筛选，获得两个活性及水溶性显著增强的丹参酮Ⅰ新型衍生物S222及S439;并以这两个衍生物为代表对丹参酮Ⅰ及其衍生物的抗肿瘤作用、作用靶点及作用机制进行了系统研究。阐释了丹参酮Ⅰ及其衍生物下调p-Y705-Stat3的作用与其抗耐药、抗血管生成及抗转移的相关性，明确了丹参酮Ⅰ及其衍生物杀伤肿瘤细胞的直接作用靶点是Top1和Top2，并对抑制Top介导的抗肿瘤作用机制进行了研究。丹参酮Ⅰ及其衍生物是一类全新结构的Top1/2抑制剂，这些结果将有助于推动以丹参酮Ⅰ为母体化合物的衍生物结构优化工作，为将丹参酮Ⅰ衍生物开发为新型Top1/2抑制剂或抗多药耐药、抗转移的抗肿瘤新药提供了新思路。