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新奥霉素是由诺尔斯链霉菌(Streptomyces noursei xinao-4)产生的嘧啶核苷多肽类抗生素，具有广谱抗菌活性，不但能抑制细菌、真菌，还具有抗病毒活性。目前，新奥霉素已经实现了中试生产，但其生物合成机理还不清楚。为了研究新奥霉素的生物合成机理，获得关键基因，本论文根据新奥霉素的结构和新奥霉素结构类似物的生物合成信息，筛选了可能参与新奥霉素生物合成的葡萄糖基转移酶、核苷2-脱氧核苷转移酶、胞嘧啶葡萄糖醛酸合成酶以及烯酰丙酮酸转移酶作为研究对象，克隆到2个葡萄糖基转移酶基因和1个胞嘧啶葡萄糖醛酸合成酶基因;建立了诺尔斯链霉菌的遗传操作体系;并对这3个基因进行了体内敲除和回补实验等功能研究，分析了这3个基因与新奥霉素生物合成的关系。论文共分为3章。 第一章:新奥霉素生物合成关键基因的预测，克隆和基因结构分析 根据新奥霉素的结构，并参考新奥霉素的结构类似物如米多霉素、嘧肽霉素、尼可霉素等核苷类抗生素的生物合成机理，选择了4个可能参与新奥霉素生物合成的酶，葡萄糖基转移酶、核苷2-脱氧核苷转移酶、胞嘧啶葡萄糖醛酸合成酶和烯酰丙酮酸转移酶进行了研究。通过设计兼并引物从S.noursei xinao-4基因组中克隆获得葡萄糖基转移酶基因gltⅠ，随后通过SON-PCR的方法获得gltⅠ基因的5端和3端的侧翼序列，序列全长3230bp。随后结合新奥霉素高产菌株S.noursei xinao-4基因组信息，通过本地BLAST同源比对，从S.noursei xinao-4基因组数据库中比对得到另一个可能的葡萄糖基转移酶基因gltⅡ和1个胞嘧啶葡萄糖醛酸合成酶基因，并设计引物从S.noursei xinao-4的基因组中扩增到了这两个基因的序列:一条3271 bp的葡萄糖基转移酶基因序列包含一个948 bp的完整一个葡萄糖基转移酶基因ORF命名为gltⅡ;以及一条3820 bp的胞嘧啶葡萄糖醛酸合成基因编码基因序列包括一个1194bp的cga基因ORF。 第二章:新奥霉素生产菌株S.noursei xinao-4接合转移遗传操作体系的建立 跨属接合转移在1989年由Mazodier首次建立，目前在链霉菌属中得到广泛应用。然而，由于不同的菌株具有不同的遗传背景，目前并没有一个能够普遍适用于所有链霉菌菌株的接合转移体系。参照Kieser等(1997)建立的接合转移体系进行S.noursei xinao-4的接合转移遗传操作，只能得到较少的接合子(106)，不能满足后续基因敲除实验的要求。因此，为了有效的进行S.nourseixinao-4的遗传操作，本论文对可能影响接合转移效率的6个因素（接合转移培养基的选择、Mg2+浓度、孢子热激温度、孢子预培养时间、供受体比例以及抗生素覆盖时间）进行了优化，发现S.noursei xinao-4孢子在50℃条件下，热激10 min，立即与生长到OD0.4-0.6的Escherichia coli ET12567按照1∶100的比例，混合均匀，涂布于2CMY培养基上，30℃培养22 h，覆盖抗生素，30℃继续培养3-4d，可获得较高的接合转移效率，最高可达8×10-3(pSET152载体)，能够满足后续基因功能分析。在所研究的条件中，大肠杆菌数与S.noursei xinao-4孢子数（供受体）的比例对接合转移的效率影响最大，当供受体比例从1∶1增加到100∶1，接合转移的效率提高了34倍。该接合转移体系的建立为本研究的后续遗传操作及实验室其它基因的功能研究奠定了基础，也为其它链霉菌菌株的遗传操作体系的建立提供了参考和借鉴。 第三章:葡萄糖基转移酶(gltⅠ，gltⅡ)，胞嘧啶葡萄糖醛酸合成酶(cga)的功能研究 为了研究这3个基因与新奥霉素生物合成的关系，本论文采用基因同源重组双交换的方法，对新奥霉素生产菌S.noursei xinao-4中gltⅠ、gltⅡ和cga基因分别进行了基因敲除和回补实验等功能研究。 自杀型载体pOJ260和温敏型载体pKC1139是在链霉菌基因敲除工作中常用的两个载体。为了比较这两个载体在基因敲除中的敲除效率，我们分别以这两个载体为接合转移载体构建了gltⅠ基因的两个敲除载体pOJ2601和pKC1139-1，并通过接合转移转化S.noursei xinao-4。以pOJ2601为敲除载体，获得了3个gltⅠ基因的敲除突变体S.noursei M1～M3;而以pKC1139-1获得了19个敲除突变体。研究结果表明，温敏型载体pKC1139更容易获得敲除突变株。 经过基因敲除，每个菌株获得来自不同批次的两个以上的敲除突变体，共获得了敲除突变体27株。采用生测的方法检测突变株和出发菌株的新奥霉素产量。体内敲除和回补实验结果表明，葡萄糖基转移酶（gltⅡ）敲除突变体S.nourseiM23，S.noursei M24和S.noursei M25，以及胞嘧啶葡萄糖醛酸合成酶（cga）敲除突变体S.noursei M26和S.noursei M27不能合成新奥霉素;S.noursei M23～M25回补突变体S.noursei C1～C3以及S.noursei M26和S.nourseiM27的回补突变株S.noursei C4和S.noursei C5恢复了新奥霉素的生产;然而葡萄糖基转移酶(gltⅠ)突变株S.noursei M1～M22的新奥霉素产量与出发菌株相比，无显著差异，表明gltⅡ和cga在新奥霉素的生物合成过程中起着重要作用，而gltⅠ可能并不参与S.noursei xinao-4中新奥霉素的生物合成。 本论文建立一个适用于新奥霉素生产菌S.noursei xinao-4的高效遗传转化体系，为以后该菌的分子生物学研究提供了一个有效的工具，同时也为其它菌株的遗传体系建立提供了借鉴和参考;并首次证实了葡萄糖基转移酶(gltⅡ)和胞嘧啶葡萄糖醛酸合成酶(cga)在新奥霉素的生物合成过程中起着重要作用，为进一步解析新奥霉素的生物合成途径，探索其分子机理，提高新奥霉素产量打下了基础。