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背景及目的:胆管细胞癌是一种肝胆系统常见的恶性肿瘤,在肝胆系统肿瘤中,其发病率仅次于肝细胞癌。手术治疗为其最主要的治疗方式,但由于胆管癌症状不典型、病变部位较深、恶性程度较高等原因,其在诊断时大多数患者已丧失根治性切除的机会。以顺铂为主的辅助性化疗为临床指南推荐的主要化疗方式,但胆管细胞癌具有天然或获得性顺铂耐药性,因此,探究胆管细胞癌的顺铂耐药机制具有极其重要的意义,然而关于胆管细胞癌顺铂耐药机制的研究较少。目前认为,胆管细胞癌顺铂耐药机制有:细胞内药物蓄积不足、DNA修复及合成异常、凋亡相关信号通路异常、线粒体动力学异常。本研究旨在从线粒体动力学角度,研究其与细胞骨架的关系,探索胆管癌的顺铂耐药机制,为胆管癌的治疗提供有效的参考方向。研究方法:以人胆管癌细胞RBE为主要研究对象,设计顺铂浓度为0ug/ml、25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml,其中0ug/ml为正常对照组,采用不同作用时间(6h、12h、20h);使用MTT法检测细胞生存率;使用Western blot技术检测细胞总蛋白中线粒体分裂融合相关蛋白Mfn1、Mfn2、OPA1、Fis1、Drp1,检测细胞总蛋白中细胞骨架相关蛋白F-actin等;使用线粒体分离试剂盒分离细胞线粒体以及细胞胞浆蛋白,Western blot技术检测线粒体分裂融合相关蛋白;使用线粒体分离试剂盒分离细胞线粒体以及细胞胞浆蛋白,Western blot技术检测细胞骨架相关蛋白;使用线粒体特异标记染料标记线粒体,激光共聚焦观察或透射电镜观察线粒体形态变化;使用细胞骨架特异染料对细胞骨架染色,激光共聚焦观察其聚合及定位;联合使用各种细胞骨架抑制剂,观察胆管癌细胞对顺铂的敏感性的改变。研究结果:(1)不同浓度顺铂(0ug/ml、25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml)作用于RBE细胞不同时间(6小时、12小时、20小时)后,细胞线粒体发生改变,其中12小时及20小时药物组能够明显促进线粒体变为融合态。(2)不同浓度顺铂(0ug/ml、25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml)作用于RBE细胞20小时后,电镜观察亦发现细胞线粒体变长。(3)线粒体分裂融合相关蛋白表达情况:在细胞总蛋白中,6小时药物组RBE细胞Mfn1、Mfn2、OPA1蛋白水平较对照组无明显差异,Fis1蛋白水平上调;12小时药物组RBE细胞Mfn1、Mfn2、OPA1、Fis1蛋白水平较对照组无明显差异;20小时药物组RBE细胞Mfn1、Mfn2、OPA1蛋白水平较对照组无明显差异,Drp1蛋白水平下调,Fis1蛋白水平上调;在20小时药物作用RBE细胞线粒体蛋白中,Mfn2、Drp1蛋白水平较对照组下调;在胞浆蛋白中,Drp1蛋白水平较对照组下调。(4)细胞骨架相关蛋白表达情况:6小时药物组RBE细胞F-actin、non muscle Heacy Myosin Chain IIB(NM IIB)较对照组无明显差异;12小时药物组RBE细胞F-actin蛋白水平较对照组无明显差异,non-muscle Heavy Myosin Chain IIA(NM IIA)、NM IIB蛋白水平下调;20小时药物组RBE细胞F-actin蛋白水平较对照组无明显差异,NM IIB,NM IIA蛋白水平在100ug/ml药物组下调;在20小时药物作用RBE细胞线粒体蛋白中,F-actin蛋白水平较对照组无明显差异,NM IIA、NM IIB蛋白水平下调;在胞浆蛋白中,F-actin蛋白水平较对照组无明显差异,NM IIA、NM IIB蛋白水平下调。(5)不同浓度顺铂(0ug/ml、25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml)作用于RBE细胞不同时间(6小时、12小时、20小时)后,细胞骨架发生改变。(6)不同浓度Blebbistatin作用于RBE细胞后,RBE细胞骨架成束被抑制,线粒体变为融合态。(7)Blebbistatin、Latrunculin A、Latrunculin B作用于RBE细胞后,其顺铂耐药性增;CCCP作用于RBE细胞后,其顺铂敏感性增强。研究结论:顺铂作用于人胆管癌细胞RBE,能够促进其部分线粒体融合,以及细胞骨架蛋白结构的改变。胆管癌细胞的线粒体动力学以及细胞骨架的变化可能与胆管癌顺铂耐药性有关。