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沙门菌是一种兼性胞内寄生的革兰阴性病原菌,目前已鉴定出2,600多种血清型,其中,鸡白痢沙门菌(Salmonella enterica serovar Pullorum, Salmonella Pullorum)作为宿主专嗜性致病菌,主要侵害20日龄以内的雏鸡,发病表现为急性的败血经过,以发热、拉白色粥样或黏性粪便为特征,具有高致病性和高死亡率。成年鸡感染鸡白痢沙门菌后多成为隐性的、无症状的带菌鸡,且该病原菌可经卵巢垂直传播。鸡白痢沙门菌在西方一些发达国家已基本被清除,但在包括我国在内的发展中国家仍然流行,给家禽养殖业带来了严重的经济损失。因此,对鸡白痢致病机制的探究有助于研究出安全、有效的鸡白痢防治措施,在降低鸡白痢发病率、提高雏鸡成活率等方面都具有十分重要的意义。沙门菌对宿主细胞的侵袭能力及其胞内存活、增殖能力与沙门菌致病岛(Salmonella pathogenicity island, SPI)相关,其中SPI-1, SPI-2编码的III型分泌系统(type III secretion system, T3SS)通过分泌相关效应蛋白来干扰宿主细胞正常的免疫应答,是沙门菌细胞内存活以及致病的关键因素之一。目前对SPI编码的T3SS的研究主要以肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌感染哺乳动物为模型,而在其它沙门菌感染模型中研究较少。鉴于鸡白痢沙门菌的特殊性(如宿主专嗜性,无鞭毛等),其T3SS效应蛋白值得研究,但未深入开展。本研究成功构建了鸡白痢沙门菌S06004 sseL基因缺失株、回复株以及真核表达质粒pcDNA3.1-SseL-flag,对鸡白痢沙门菌S06004 SseL效应蛋白毒力调节作用及抑制细胞NF-κB炎性通路进行了初步的研究。1.鸡白痢沙门菌S06004 sseL基因缺失株的构建及其毒力评价本研究利用γ-Red同源重组系统对鸡白痢沙门菌S06004 sseL基因进行了敲除,成功构建了鸡白痢沙门菌缺失株S06004AsseL;并通过重组子成功构建回复株S06004ΔsseL::sseL。PCR试验与测序结果表明,S06004ΔsseL的sseL基因被成功敲除。与野生株S06004相比,sseL基因缺失株、回复株的生长、生化特性没有显著差异。对沙门菌菌株进行毒力评价,结果显示,S06004ΔsseL的LD50(约为8.79×108 CFU)较野生株S06004的LD50(约为1.62×107 CFU)升高了约60倍,而回复株LD50(1.76×108)仅升高了约10倍,说明回复株毒力有所回复。与野生株相比,sseL基因缺失株、回复株对禽巨噬细胞HD-11的黏附、侵袭率没有显著差异,但缺失株在细胞内的增殖能力显著降低,在增殖过程的4个时间点(0,2,5,10 h)中,5h和10 h的增殖倍数明显低于(约2倍)野生株(P<0.05),而回复株的增殖能力有所回复。鸡白痢沙门菌感染细胞后,通过HD-11活细胞计数比较显示,缺失株感染后10h的活细胞比率为69.3%,明显高于野生株感染后10h的活细胞比率(40.6%)(P<0.05)。此外,体内外竞争生长实验结果显示,缺失株和野生株的体外竞争生长指数为0.42±0.05；感染海兰白雏鸡后3d和5d,脾脏内竞争生长指数分别0.24±0.03和0.46±0.012,肝脏中竞争生长指数分别为0.25±0.02和0.57±0.046(P<0.05)。因此,sseL基因缺失株与野生株体外竞争生长能力差别不显著,而体内竞争生长能力在3d时显著弱于野生株,5d时差别不显著。2.鸡白痢沙门菌效应蛋白SseL抑制细胞NF-κB炎性通路初步研究野生株与缺失株分别感染HD-11细胞,感染后8h提取细胞总RNA,荧光定量PCR检测相关细胞因子IL-1β, IL-4, IL-6, IFN-γ, CXCLi2, CCLi2, NKAP, TANK, MUL1, NKIRA的mRNA表达量。结果显示,与野生株感染组相比,缺失株感染组炎性细胞因子IL-4, IFN-γ, CXCLi2, CCLi2的表达明显上调(P<0.05),且NF-κB相关细胞因子NKAP, TANK的表达也有明显上调(P<0.05)。本研究成功构建了鸡白痢沙门菌真核表达质粒pcDNA3.1-SseL(S06004)-flag与鼠伤寒沙门菌真核表达质粒pcDNA3.1-SseL(SL1344)-flag。真核表达质粒分别转染HEK293细胞后,收集细胞裂解液进行Western-blot分析,检测到37 kDa左右的目的蛋白,表明SseL在HEK293细胞中得到表达。将真核表达质粒、pCMV-TRL4、pCMV-MD2、NF-κB荧光素酶报告基因共转染HEK293细胞,LPS刺激后,检测SseL的表达对NF-κB炎性通路的影响,结果表明鸡白痢沙门菌与鼠伤寒沙门菌效应蛋白SseL的表达都能够抑制NF-κB炎性通路的激活,与阴性对照组相比抑制效果达2-3倍(P<0.05),且鸡白痢沙门菌效应蛋白SseL抑制NF-κB炎性信号通路的程度,与鼠伤寒沙门菌效应蛋白SseL相比,没有明显差异。综上所述,鸡白痢沙门菌T3SS2效应蛋白SseL编码基因sseL是一个重要的毒力基因,且SseL作为一种去泛素化酶能够靶作用于细胞NF-κB信号途径,抑制NF-κB信号通路的激活,进而发挥抑制炎性反应的作用。