论文部分内容阅读
琥珀酸，四碳二元酸的一种，作为三羧酸循环的中间代谢物，在生物的代谢中占有非常重要的地位。琥珀酸是一种重要的化工原料，大约有250种以苯为原料生产的化工产品都可以通过琥珀酸平台生产，广泛地用于医药、食品和可降解塑料等工业。微生物利用可再生资源发酵生产琥珀酸是当今世界研究和开发的一个热点。
代谢工程大肠杆菌NZN111，野生菌W1485的丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)和乳酸脱氢酶(LDH)双突变株，缺失了乳酸和甲酸等琥珀酸合成的竞争途径。研究人员构建该突变株时以为其可成为优秀的琥珀酸生产菌，但厌氧条件下该菌株在即使添加了乙酸盐的复合培养基中也不能利用葡萄糖正常生长，葡萄糖代谢能力受到严重损害。研究者普遍认为这是由于LDH和PFL缺失造成糖酵解途径产生的NADH不能被有效氧化成NAD+，氧化还原平衡遭到破坏所致。本研究以代谢和调控理论为基础，通过两阶段发酵中有氧阶段的代谢调控恢复了NZN111在厌氧条件下快速代谢葡萄糖生产琥珀酸的能力，并根据琥珀酸合成过程的代谢特性对厌氧发酵过程中CO2的吸收进行初步研究，得到如下主要结果：
利用糖异生碳源好氧培养的NZN111在没有经过进一步遗传修饰情况下恢复了厌氧条件下快速代谢葡萄糖的能力，而且琥珀酸成为主要的代谢产物，得率和生产速率都有了极大的提高。酶活分析表明，这些碳源培养的NZN111中，与琥珀酸合成密切相关的酶活性分布与天然琥珀酸生产菌A.succinogenes130Z非常相似，补给途径、TCA还原段以及乙醛酸支路的酶活得到了很大的诱导。NZN111不能厌氧代谢葡萄糖生产琥珀酸，主要是由于它的代谢网络中补给途径和TCA还原段酶系活力不够，不能有效氧化EMP途径产生的NADH，导致了胞内氧还平衡失调。本研究采用糖异生碳源好氧培养NZN111，在厌氧摇瓶实验中琥珀酸的最高得率为1.32mol·mol-1，达到NZN111中过量表达丙酮酸羧化酶的理论得率(1.33mol·mol-1)，副产物主要是乙酸，乙醇含量很少。糖异生碳源培养的NZN111细胞中上调的苹果酸酶(malic enzyme,ME)或磷酸烯醇式丙酮酸合成(phosphoenolpyruvate synthase,PPS)活性很可能将部分丙酮酸转向了琥珀酸。
在5-L发酵罐中采用基本培养基进行NZN111的两阶段分批补料培养，琥珀酸最高终浓度和得率达到了58.9g·L-1和1.55mol·mol-1，生产速率远远优于文献报道的相同菌株水平。厌氧发酵过程中葡萄糖消耗和琥珀酸生产速率不断下降，厌氧阶段初始葡萄糖浓度的对其影响不大，但产物琥珀酸的抑制作用严重，琥珀酸对细胞的毒性随着琥珀酸的积累而增加，当发酵液中琥珀酸浓度超过30g·L-1，NZN111的葡萄糖消耗和琥珀酸生产能力快速降低。代谢副产物乙酸和丙酮酸由于积累量较少，因而对葡萄糖代谢和琥珀酸的生产几乎没有影响。
摇瓶实验显示了CO2对琥珀酸合成的重要性，即便是具有高琥珀酸生产性能的细胞，在缺乏CO2的厌氧发酵体系中不能有效合成琥珀酸。采用无定子自吸式搅拌桨实现罐内CO2的不断循环，有效地为琥珀酸发酵提供CO2，并且避免了采用常规通气造成的大量CO2释放。采用自吸式搅拌桨进行内部CO2循环时，NZN111生产琥珀酸的性能与采用直接从CO2钢瓶鼓泡通气接近。发酵液的pH影响CO2的吸收，当pH控制在6.3时，虽然发酵过程中吸收的CO2明显降低，但琥珀酸的合成没有受到影响，反映了CO2的利用效率提高，避免了大量CO2溶解在发酵液中的浪费。根据物料平衡对厌氧发酵阶段CO2的固定进行了计算，琥珀酸主要是通过补给途径和TCA还原段还原合成的，乙醛酸支路的贡献较小，基于琥珀酸的CO2固定率最低可以达到0.326mol·mol-1，在实验FB-7中基本可以实现将吸收的CO2用于琥珀酸的合成。
本研究还进行了NZN111琥珀酸发酵和安琪酵母乙醇发酵的偶联，实现了琥珀酸发酵利用乙醇发酵产生的CO2。NZN111利用10g(湿细胞)·L-1安琪酵母乙醇发酵产生的CO2，产生了41.6g·L-1的琥珀酸，琥珀酸关于葡萄糖的得率达到1.30mol·mol-1。