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目的
类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性自身免疫性疾病，软骨的破坏是RA患者致残的根本原因之一。酸敏感离子通道1a(ASIC1a)是一类可由胞外酸化所激活的阳离子通道，广泛存在于细胞膜上。课题组前期研究结果表明，在AA大鼠关节软骨中，存在ASIC1a的表达，且可以促进大鼠关节软骨NLRP3炎症小体的表达。然而，其潜在机制尚不清楚。本研究进一步证实了ASIC1a对大鼠关节软骨中NLRP3炎症小体表达的作用，并探讨了其可能的分子机制以及NLRP3炎症小体的激活对关节软骨的影响。
方法
1.在体内使用CFA试剂构建AA大鼠模型，观察造模不同时期，NLRP3炎症小体表达的动态变化。分别在造模第0、7、14、21、28、35天时将大鼠处死，利用苏木精、伊红(HE)染色法观察大鼠踝关节病理变化，免疫组化和Westernblot检测关节软骨组织NLRP3炎症小体相关蛋白nod-likereceptorprotein3(NLRP3),apoptosis-associatedspeck-likeprotein(ASC),caspase-1的表达变化。
2.在体外观察，酸化处理对大鼠关节软骨细胞NLRP3炎症小体表达的影响。原代大鼠关节软骨细胞在不同酸性浓度(pH 7.4、pH 7.0、pH 6.5、pH 6.0、pH 5.5)条件下处理24小时及在pH6.0条件下酸化不同时间(0、3、6、12、24 h)。然后利用Westernblot法检测蛋白ASIC1a、NLRP3、ASC、caspase-1的表达；qRT-PCR法检测NLRP3,ASC,caspase-1mRNA的表达。
3.在体外观察，阻断和沉默ASIC1a对大鼠关节软骨细胞NLRP3炎症小体表达的影响。原代大鼠关节软骨细胞分为:pH7.4正常组、pH6.0酸化组、pH6.0+NC组、pH6.0+ASIC1ashRNA组以及pH6.0+ASIC1a特异性抑制剂PcTx-1(100ng/ml)组。利用Westernblot检测ASIC1a,NLRP3,ASC,caspase-1,NF-κBp65,NF-κBpp65的表达水平。结果表明阻断和沉默ASIC1a，能够明显降低NLRP3炎症小体及NF-κB的表达。
4.在体外观察，NF-κB信号通路在ASIC1a介导的NLRP3炎症小体表达中的作用。原代大鼠关节软骨细胞分为以下三组:pH7.4正常组、pH6.0酸化组以及pH6.0+NF-κB特异性抑制剂BAY11-7082(10uMl)组。利用Westernblot和细胞免疫荧光方法检测NF-κB表达情况，利用Westernblot，qRT-PCR以及ELISA方法检测NLRP3,ASC,caspase-1以及IL-1β的表达情况。
5.在体外观察，NLRP3炎症小体的激活在大鼠关节软骨中的作用。原代大鼠关节软骨细胞分为以下三组:pH7.4正常组、pH6.0酸化组以及pH6.0+caspae-1特异性抑制剂AC-YVAD-CHO(10uMl)组。利用Westernblot，qRT-PCR以及caspase-1检测试剂盒检测caspase-1表达情况，利用AO-EB染色，LDH以及MTT方法检测大鼠关节软骨细胞活性，利用Westernblot方法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3以及cleaved-caspase-3的表达情况，流式细胞术检测凋亡率，利用qRT-PCR和ELISA方法检测IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。
结果
1.体内实验结果表明，在AA大鼠关节软骨中存在NLRP3炎症小体的表达。HE染色结果表明：与正常组相比，造模组大鼠关节出现明显损害，具体表现为造模组大鼠关节面凹凸不平，存在明显的滑膜组织异常增生及炎性细胞浸润。这种破坏情况从造模的第1天到28天呈现递增趋势，35天时有所改善。免疫组化和Westernblot结果显示，与正常大鼠相比，造模组大鼠关节软骨中NLRP3,ASC和caspase-1蛋白表达显著增加，且呈现时间依赖性，在第28或35天时表达最为明显。体外实验表明，胞外酸化能上调大鼠关节软骨细胞NLRP3炎症小体的表达水平，且pH6.0处理24h后mRNA和蛋白表达水平显著增加。
2.ASIC1a促进胞外酸化诱导的大鼠关节软骨细胞NLRP3炎症小体的表达。由Westernblot结果可看出，酸性条件刺激下(pH 6.0),ASIC1a以及NLRP3相关蛋白表达量明显增加。沉默和阻断ASIC1a，能够明显降低酸诱导的NLRP3炎症小体相关蛋白(NLRP3, ASC, caspase-1)水平。结果表明，ASIC1a可参与大鼠关节软骨细胞中NLRP3炎症小体的表达。
3.NF-κB信号通路参与由ASIC1a介导的大鼠关节软骨细胞NLRP3炎症小体的表达。Westernblot结果显示，酸性条件能使软骨细胞中NF-κB信号通路激活，然而，用shRNA沉默ASIC1a以及使用PcTx-1抑制ASIC1a，NF-κB磷酸化水平降低。使用NF-κB信号通路特异性抑制剂BAY11-7082，可显著降低酸诱导的NLRP3,ASC,caspase-1以及IL-1β基因和蛋白的表达。这些结果表明NF-κB信号通路在ASIC1a介导的大鼠关节软骨细胞NLRP3炎症小体的表达中发挥重要作用。
4.NLRP3炎症小体的激活可以促进酸诱导的大鼠关节软骨细胞发生细胞凋亡并促进炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α产生。AO-EB染色,、LDH及MTT结果显示，酸化刺激，能够明显降低关节软骨细胞活性，然而使用caspase-1特异性抑制剂AC-YVAD-CHO抑制NLRP3炎症小体激活后，关节软骨细胞活性得到明显改善。Westernblot结果表明，抑制NLRP3炎症小体激活，能够明显降低由胞外酸化诱导的关节软骨细胞凋亡相关蛋白表达水平，细胞流式术结果与此相一致。ELISA和qRT-PCR结果显示，抑制NLRP3炎症小体激活，能够明显降低由胞外酸化诱导的软骨细胞炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平，综上，可看出NLRP3炎症小体的激活可以促进大鼠关节软骨细胞发生凋亡并促进炎症因子的产生，加剧炎症反应，从而对关节软骨产生作用。
结论
1.ASIC1a的激活促进了大鼠关节软骨细胞NLRP3炎症小体的表达，其可能与NF-κB信号通路有关。
2.NLRP3炎症小体的激活能够诱导大鼠关节软骨细胞发生凋亡，并产生大量的炎症因子。
3.NLRP3炎症小体以及相关信号通路的研究，将扩展我们对ASIC1a功能的认识，为针对关节软骨损伤治疗RA提供一种新的思路。
类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性自身免疫性疾病，软骨的破坏是RA患者致残的根本原因之一。酸敏感离子通道1a(ASIC1a)是一类可由胞外酸化所激活的阳离子通道，广泛存在于细胞膜上。课题组前期研究结果表明，在AA大鼠关节软骨中，存在ASIC1a的表达，且可以促进大鼠关节软骨NLRP3炎症小体的表达。然而，其潜在机制尚不清楚。本研究进一步证实了ASIC1a对大鼠关节软骨中NLRP3炎症小体表达的作用，并探讨了其可能的分子机制以及NLRP3炎症小体的激活对关节软骨的影响。
方法
1.在体内使用CFA试剂构建AA大鼠模型，观察造模不同时期，NLRP3炎症小体表达的动态变化。分别在造模第0、7、14、21、28、35天时将大鼠处死，利用苏木精、伊红(HE)染色法观察大鼠踝关节病理变化，免疫组化和Westernblot检测关节软骨组织NLRP3炎症小体相关蛋白nod-likereceptorprotein3(NLRP3),apoptosis-associatedspeck-likeprotein(ASC),caspase-1的表达变化。
2.在体外观察，酸化处理对大鼠关节软骨细胞NLRP3炎症小体表达的影响。原代大鼠关节软骨细胞在不同酸性浓度(pH 7.4、pH 7.0、pH 6.5、pH 6.0、pH 5.5)条件下处理24小时及在pH6.0条件下酸化不同时间(0、3、6、12、24 h)。然后利用Westernblot法检测蛋白ASIC1a、NLRP3、ASC、caspase-1的表达；qRT-PCR法检测NLRP3,ASC,caspase-1mRNA的表达。
3.在体外观察，阻断和沉默ASIC1a对大鼠关节软骨细胞NLRP3炎症小体表达的影响。原代大鼠关节软骨细胞分为:pH7.4正常组、pH6.0酸化组、pH6.0+NC组、pH6.0+ASIC1ashRNA组以及pH6.0+ASIC1a特异性抑制剂PcTx-1(100ng/ml)组。利用Westernblot检测ASIC1a,NLRP3,ASC,caspase-1,NF-κBp65,NF-κBpp65的表达水平。结果表明阻断和沉默ASIC1a，能够明显降低NLRP3炎症小体及NF-κB的表达。
4.在体外观察，NF-κB信号通路在ASIC1a介导的NLRP3炎症小体表达中的作用。原代大鼠关节软骨细胞分为以下三组:pH7.4正常组、pH6.0酸化组以及pH6.0+NF-κB特异性抑制剂BAY11-7082(10uMl)组。利用Westernblot和细胞免疫荧光方法检测NF-κB表达情况，利用Westernblot，qRT-PCR以及ELISA方法检测NLRP3,ASC,caspase-1以及IL-1β的表达情况。
5.在体外观察，NLRP3炎症小体的激活在大鼠关节软骨中的作用。原代大鼠关节软骨细胞分为以下三组:pH7.4正常组、pH6.0酸化组以及pH6.0+caspae-1特异性抑制剂AC-YVAD-CHO(10uMl)组。利用Westernblot，qRT-PCR以及caspase-1检测试剂盒检测caspase-1表达情况，利用AO-EB染色，LDH以及MTT方法检测大鼠关节软骨细胞活性，利用Westernblot方法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3以及cleaved-caspase-3的表达情况，流式细胞术检测凋亡率，利用qRT-PCR和ELISA方法检测IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。
结果
1.体内实验结果表明，在AA大鼠关节软骨中存在NLRP3炎症小体的表达。HE染色结果表明：与正常组相比，造模组大鼠关节出现明显损害，具体表现为造模组大鼠关节面凹凸不平，存在明显的滑膜组织异常增生及炎性细胞浸润。这种破坏情况从造模的第1天到28天呈现递增趋势，35天时有所改善。免疫组化和Westernblot结果显示，与正常大鼠相比，造模组大鼠关节软骨中NLRP3,ASC和caspase-1蛋白表达显著增加，且呈现时间依赖性，在第28或35天时表达最为明显。体外实验表明，胞外酸化能上调大鼠关节软骨细胞NLRP3炎症小体的表达水平，且pH6.0处理24h后mRNA和蛋白表达水平显著增加。
2.ASIC1a促进胞外酸化诱导的大鼠关节软骨细胞NLRP3炎症小体的表达。由Westernblot结果可看出，酸性条件刺激下(pH 6.0),ASIC1a以及NLRP3相关蛋白表达量明显增加。沉默和阻断ASIC1a，能够明显降低酸诱导的NLRP3炎症小体相关蛋白(NLRP3, ASC, caspase-1)水平。结果表明，ASIC1a可参与大鼠关节软骨细胞中NLRP3炎症小体的表达。
3.NF-κB信号通路参与由ASIC1a介导的大鼠关节软骨细胞NLRP3炎症小体的表达。Westernblot结果显示，酸性条件能使软骨细胞中NF-κB信号通路激活，然而，用shRNA沉默ASIC1a以及使用PcTx-1抑制ASIC1a，NF-κB磷酸化水平降低。使用NF-κB信号通路特异性抑制剂BAY11-7082，可显著降低酸诱导的NLRP3,ASC,caspase-1以及IL-1β基因和蛋白的表达。这些结果表明NF-κB信号通路在ASIC1a介导的大鼠关节软骨细胞NLRP3炎症小体的表达中发挥重要作用。
4.NLRP3炎症小体的激活可以促进酸诱导的大鼠关节软骨细胞发生细胞凋亡并促进炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α产生。AO-EB染色,、LDH及MTT结果显示，酸化刺激，能够明显降低关节软骨细胞活性，然而使用caspase-1特异性抑制剂AC-YVAD-CHO抑制NLRP3炎症小体激活后，关节软骨细胞活性得到明显改善。Westernblot结果表明，抑制NLRP3炎症小体激活，能够明显降低由胞外酸化诱导的关节软骨细胞凋亡相关蛋白表达水平，细胞流式术结果与此相一致。ELISA和qRT-PCR结果显示，抑制NLRP3炎症小体激活，能够明显降低由胞外酸化诱导的软骨细胞炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平，综上，可看出NLRP3炎症小体的激活可以促进大鼠关节软骨细胞发生凋亡并促进炎症因子的产生，加剧炎症反应，从而对关节软骨产生作用。
结论
1.ASIC1a的激活促进了大鼠关节软骨细胞NLRP3炎症小体的表达，其可能与NF-κB信号通路有关。
2.NLRP3炎症小体的激活能够诱导大鼠关节软骨细胞发生凋亡，并产生大量的炎症因子。
3.NLRP3炎症小体以及相关信号通路的研究，将扩展我们对ASIC1a功能的认识，为针对关节软骨损伤治疗RA提供一种新的思路。