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缺血性中风是现代医学研究中的一个重大难题,由包括血管阻塞在内的多种原因而造成脑缺血损伤。复方当归注射液(Compound angelica injection,CAI)由当归、川芎、红花三味中药提炼而成,具有良好的活血通络之功。前期研究发现CAI对脑缺血损伤模型具有一定的治疗作用。神经血管单元(Neurovascularunit,NVU)概念的提出扩大了脑缺血损伤研究的视野。血脑屏障(Blood-brainbarrier,BBB)和神经元都是NVU的重要组成部分,也是脑缺血损伤研究中的重要靶点。本研究将以课题组前期的实验结果为基础,从神经血管单元出发,研究CAI对脑缺血损伤的影响。目的:通过建立大鼠永久性大脑中动脉闭塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,研究CAI干预后对大鼠神经行为学、病理形态学以及与BBB关系密切的基质金属蛋白酶(Matrix metal protein,MMP)-2和MMP-9表达的影响;利用CAI作用脑微血管内皮细胞(Brainmicrovascularendothelial cells,BMECs)后的条件培养液干预神经元,探究CAI对神经元拟缺血损伤模型的作用及可能的分子机制。方法:(1)MCAO大鼠行为学及形态学观察:SD大鼠随机分出假手术组(生理盐水3mL/kg),其余建立大鼠右侧MCAO脑缺血模型。采用Z.Longa5级评分法将造模大鼠平均分成模型组(生理盐水3mL/kg)、阳性对照组(依达拉奉注射液3mL/kg)、CAI组(CAI 10 mL/kg),在干预1d、3d、7 d、14 d后再次评分,评价CAI对脑缺血损伤大鼠神经功能行为学的影响;用苏木素-伊红(Hematoxylin-Eosin,HE)染色法观察各组大鼠脑组织病理形态学变化。(2)采用免疫组化法分析各组大鼠大脑缺血区皮层组织中MMP-2和MMP-9的表达。(3)原代培养BMECs传至第三代,采用CD31相关抗原进行免疫荧光鉴定;将BMECs 分为正常组、模型组和 CAI 低(1.25 μL/mL)、中(2.5 μL/mL)、高(5μL/mL)剂量组。模型组和CAI组采用氧糖剥夺(Oxygen and glucose deprivation,OGD)法建立BMECs拟缺血损伤模型。收集BMECs正常组的条件培养液(Normal-Conditioned medium,N-CM)、拟缺血模型组的条件培养液(Ischemic-Conditionedmedium,I-CM)及不同剂量CAI组拟缺血损伤后的条件培养液(Ischemic CAI-Conditioned medium,IC-CM),其中,1.25 γL/mLCAI 作用 BMECs 的 IC-CM 作为 IC-CML,2.5 μL/mL CAI 作用的 IC-CM作为IC-CMM,5μL/mLCAI作用的IC-CM作为IC-CMH;原代培养神经元,采用NSE相关抗原对神经元进行免疫荧光鉴定;将神经元分为5组(N-CM、I-CM、IC-CML、IC-CMM、IC-CMH组),分别将对应的内皮细胞条件液作用神经元,除N-CM组,其余组均用OGD造模6 h,之后通过CCK-8检测各组神经元的活性。(4)神经元PI3K/Akt和MAPK/Erk通路的相关指标检测:采用PCR法检测各组神经元Akt mRNA的表达水平,采用Western blot法检测各组神经元Akt的磷酸化水平(p-Akt/Akt)和 Erk 的磷酸化水平(p-Erk/Erk)。结果:(1)模型组大鼠的神经功能损伤逐渐加重,第7d时最为严重,CAI干预后可减轻大鼠的神经功能损伤,在7 d、14 d时,CAI组同模型组相比较,差异有统计学意义。HE染色结果显示,各时间点模型组的脑组织均呈现明显的损伤性变化,坏死明显。而阳性对照组和CAI组在干预7 d、14d后,对比模型组有较明显改善。(2)脑缺血时,缺血区皮层MMP-2随着缺血时间的增加而表达逐渐增多,在4个时间点中的表达以7d为峰值,到了 14d时表达减少;相较于模型组,CAI药物干预可降低MMP-2的表达,并在3 d、7 d时差异有统计学意义。MMP-9的高表达出现在早期,在1d时最高,3d、7 d都有所下降,14 d有上升趋势,CAI组相较于模型组1d、3d的表达降低,差异具有统计学意义。(3)OGD造模后,I-CM组神经元活性相较于N-CM组显著降低,CAI干预后的IC-CM组神经元活性随着药物浓度增加而逐渐升高。(4)与N-CM组相比,I-CM组神经元Akt mRNA表达显著减少,各IC-CM组神经元的Akt mRNA表达随着药物浓度增加均呈逐渐升高趋势,其中IC-CMH组的Akt mRNA同I-CM组比较差异有统计学意义;神经元的p-Akt/Akt同Akt的mRNA表达结果的趋势相似,同I-CM组比较,IC-CML组差异有统计学意义,IC-CMM和IC-CMH组差异显著。与N-CM组相比,I-CM组神经元p-Erk/Erk显著升高,CAI干预后的各IC-CM组有出现降低趋势,但相较于I-CM组统计均无差异。结论:CAI可改善模型大鼠神经功能和病理损伤,其作用可能与调控脑缺血损伤大鼠皮层与BBB有关的MMP-2和MMP-9表达有关;CAI作用的BMECs条件液活化神经元PI3K/Akt信号通路提高了拟缺血神经元的存活率。