【摘 要】
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背景及目的:食管癌是人类最为常见的消化道恶性肿瘤之一。近年来,食管癌在临床治疗方面有了较大的进展,但其五年生存率仍然较低,预后较差。虽然吸烟已经被证明可促使食管癌的发生,但香烟烟雾如何诱导细胞发生恶性转化,其涉及的机制尚未明确。本课题通过构建细胞模型,初步探索香烟烟雾致食管癌发生的分子机制,为食管癌防治以及精准治疗提供科学的理论依据。材料和方法:（1）香烟烟雾慢性暴露细胞模型的建立:制备香烟烟雾提
【基金项目】
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国家自然科学基金（81602878）； 广东省自然科学基金（2016A030313071）；
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背景及目的:食管癌是人类最为常见的消化道恶性肿瘤之一。近年来,食管癌在临床治疗方面有了较大的进展,但其五年生存率仍然较低,预后较差。虽然吸烟已经被证明可促使食管癌的发生,但香烟烟雾如何诱导细胞发生恶性转化,其涉及的机制尚未明确。本课题通过构建细胞模型,初步探索香烟烟雾致食管癌发生的分子机制,为食管癌防治以及精准治疗提供科学的理论依据。材料和方法:（1）香烟烟雾慢性暴露细胞模型的建立:制备香烟烟雾提取物（CSE）后,采用CCK-8实验检测CSE急性染毒对SHEE细胞的毒性剂量,确定CSE慢性染毒的浓度,构建不同代数CSE慢性染毒SHEE细胞模型。对处理30代的SHEE细胞（P30-CSE和P30-DMSO）进行平板克隆形成实验、裸鼠皮下成瘤实验、transwell实验检测细胞恶性转化程度,并用RT-q PCR检测上皮-间质转化（EMT）相关m RNA的表达水平。（2）高通量芯片筛选相关lncRNAs:提取P30-CSE和P30-DMSO细胞株RNA,利用Human LncRNA Expression Microarray V4.0检测lncRNA的水平改变,结合生物信息学分析筛选出差异表达的lncRNA,采用RT-q PCR实验在不同代数染毒的细胞和患者组织中进行验证。（3）分析lncRNA H19与患者临床病理特征的联系:通过非参数检验分析H19的相对表达水平与患者临床病理特征的关系,用Spearman相关分析探讨H19的相对表达水平与患者肿瘤大小的相关性。（4）分析H19启动子区的DNA甲基化改变:通过焦磷酸测序技术检测慢性染毒细胞和患者组织的H19 CTCF6甲基化水平,并通过Spearman相关分析探讨H19表达水平与H19 CTCF6甲基化水平的相关性,t检验分析其甲基化水平与患者临床病理特征的关系。结果:（1）通过SHEE细胞急性染毒确定慢性染毒浓度为15mg/m L。相比于对照组（P30-DMSO）,染毒组（P30-CSE）的成瘤能力显著提高,细胞恶性程度增加,表明CSE慢性暴露的体外细胞模型已成功构建。（2）高通量芯片检测结果发现,相对于正常成瘤细胞,香烟烟雾慢性暴露可引起不同的表达谱改变,并筛选出一批差异表达lncRNAs。进一步筛选和验证发现,在不同染毒代数（10、20、30、40代）细胞中,H19在CSE慢性暴露过程中表达水平逐渐升高,而LINC02582、LINC01133表达逐渐下降,LINC00342表达水平改变无明显趋势。（3）在食管鳞癌患者的组织样本中,在吸烟者中,H19在癌组织中的表达明显高于正常组织（P=0.003）,而在非吸烟患者中无明显变化（P=0.395）,这两组人群的相对表达改变水平有统计学差异（P=0.015）。其他三个lncRNAs（LINC02582、LINC01133和LINC00342）则无明显差别。在进一步分析中,我们发现,在吸烟者中,H19的相对表达水平在较高的TNM分期（III-IV期）患者中表达较高（P=0.045）;在吸烟者中H19的相对表达水平与肿瘤大小呈正相关（rs=0.373,P=0.039）,而非吸烟者则无相应趋势（P=0.212）。（4）在香烟烟雾慢性暴露细胞模型中,可以发现H19启动子区CTCF6结合位点的DNA甲基化水平下降,但未能观察到吸烟者与非吸烟者的食管癌患者组织甲基化水平的改变,且DNA甲基化水平与患者临床病理特征无显著相关。结论:香烟烟雾慢性暴露能够促使食管上皮细胞的恶性转化能力显著增强。香烟烟雾慢性暴露的食管成瘤细胞与自然成瘤细胞有显著不同的基因表达谱。LncRNA H19可能参与了香烟烟雾慢性暴露促食管鳞状细胞癌的成瘤作用,但H19的表达不受DNA甲基化的调控。
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