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蝎在地球上已经生存了4亿多年。在自然进化过程中,他们发育出了独特的毒液系统用于捕食和防御。大量研究表明了毒液中含有作用于昆虫、哺乳动物甚至人的离子通道的蝎毒素多肽,从而回答了蝎毒液毒性的科学问题。然而,蝎对自身毒液具有抗性或不敏感科学问题的研究进展非常缓慢。一个最主要的原因是难以克隆蝎离子通道基因和实现其在细胞水平上的功能表达。2013年,世界第一个蝎种,即我国东亚钳的基因组得到了解析,为蝎离子通道的发现及在此基础上蝎对自身毒素抗性研究带来了新契机。基于东亚钳蝎基因组数据,本论文通过生物信息学方法发现了一系列不同类型蝎离子通道序列信息。在此基础上,我们通过分子克隆相继获得了不同蝎离子通道的全长序列,如电压门控钾通道MmKv3、钙激活钾离子通道MmSK1、电压门控钠离子通道MmNav2、瞬间受体电位通道M亚家族基因MmTRPM-1和MmTRPM-2、瞬间受体电位通道C亚家族基因MmTRPC-1和MmTRPC-2、瞬间受体电位通道A亚家族基因MmTRPA-1、瞬间受体电位通道V亚家族基因TRPV-1。这些蝎离子通道基因为蝎对自身毒素抗性研究奠定了重要基础。在蝎离子通道发现的基础上,我们针对在细胞水平上功能表达的蝎离子通道开展了它们对毒素的抗性研究。首先,本论文开展了蝎电压门控钾离子通道MmKv1与蝎毒素相互作用研究。通道动力学研究表明了MmKv1通道是一个经典的电压门控钾离子通道,它具有电压依赖的快速激活和缓慢失活特征。电生理实验表明了1：2000稀释的东亚钳蝎毒液能够抑制71.5±1.0%的蝎毒素敏感的人源hKvl.3通道电流,但仅能够抑制16.1±0.8%的蝎MmKv1通道电流。另外,1 nM蝎毒素能够抑制71.5±1.1%的hKvl.3通道电流,但100 nM蝎毒素BmKTX-D33H仅能够抑制16.1±0.8%的MmKv1通道电流。这些电流抑制效果的显著差异表明了蝎MmKv1通道对于蝎毒液以及蝎毒素均表现出明显的不敏感特征。蝎MmKv1通道嵌合体MmKv1-TF (MmKv1通道细胞外孔区置被换成hKvl.3孔区相应结构域)的实验表明相同浓度蝎毒液对MmKv1-TF嵌合体通道和人源hKvl.3具有相近的抑制作用,从而证明了MmKv1通道细胞外孔区(包括Turret和过滤器区域1是其对蝎毒素不敏感的关键区域。当把MmKv1通道Turret上的2个碱性氨基酸残基(Arg399和Lys403)和孔区过滤器附近Arg425同时替换为hKv1.3通道上相应的氨基酸之后, 发现突变体通道MmKv1-R399T/K403S/R425H与hKv1.3通道对蝎毒液和蝎毒素也具有相近的敏感性。这些实验进一步表明这3个碱性氨基酸(Arg399、Lys403和Arg425)是MmKv1通道对毒素不敏感的原因。更为有趣的是,我们发现这3个碱性氨基酸几乎都存在于无脊椎毒液动物Shaker-like钾通道中,表明这3个碱性氨基酸可能是它们为了抵抗自身毒液趋同进化产生的结果。在蝎MmKv1通道研究的基础上本论文对来自东亚钳蝎小电导钙激活钾通道MmSK1开展了研究。蝎MmSK1通道与蝎毒素敏感的人源hSK3通道在序列和空间结构上具有显著的相似性,这完全不同于蝎MmKv1通道独特的结构特征,然而蝎MmSK1同MmKv1通道一样显示了对蝎毒素的不敏感性。电生理实验结果表明1 mg/ml东亚钳蝎毒液冻干粉的稀释液能够分别抑制80.8±0.6%的hSK3通道电流以及31.1±2.3%的MmSK1通道电流；100 nM蝎毒素ScyTx能够分别抑制77.2±5.2%的hSK3通道电流以及23.8±3.1%的MmSK1通道电流。空间结构分析初步表明了蝎MmSK1相比人SK3通道具有更紧凑的结构,这可能导致了MmSK1通道对毒素的抗性。在这些工作首次在不同钾离子通道水平上解释了蝎对自身毒液不敏感性及部分原因,加深了人类对蝎以及其它毒液动物毒素对自身毒素不敏感性的认识。鉴于作用钾离子通道蝎毒素的结构共性特征,本论文还开展了新型蝎毒素与钾离子通道的相互作用研究。Ascaris-type多肽是一类经典的蛋白酶抑制剂,具有与作用钾离子通道蝎毒素具有相似的性质。本论文发现SjAPI-2是含有5对二硫键的62个氨基酸构成,它分子内含有2个酸性氨基酸残基和10个广泛分布的碱性氨基酸残基。研究发现了SjAPI-2是一个选择性作用于KCNQ1通道的钾毒素,对于其它钾通道(如Kv1.1, Kv1.2, Kvl.3, SK2, SK3以及IK)电流几乎没有抑制作用。浓度依赖实验表明SjAPI-2抑制KCNQ1钾通道的IC50为771.5±169.9 nM。据我们所知SjAPI-2是第一个具有Ascaris-type模体的神经毒素,表明毒液动物神经毒素的趋异进化特点,从而促进了新型蝎毒素的认识与应用研究。