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慢性氟中毒不仅损害牙齿和骨骼,同时还能引起神经系统等全身各组织器官的广泛损伤。但是,关于慢性氟中毒引起神经系统损伤的发生机制尚未完全阐明清楚。近年来,发现神经信号转导通路的改变可能是慢性氟中毒致神经损伤的机制之一。为了深入进行该方面的研究,本实验复制了饮水型慢性氟中毒大鼠模型和体外染氟神经细胞模型,研究晚期糖基化终末产物(Advancedglycosylationendproducts,AGEs)及其受体(Receptorforadvancedglycationendproducts,RAGE)信号转导通路的改变,探讨其在慢性氟中毒神经损伤中的作用机制。 AGEs是一类由蛋白质、核酸及脂质与糖在非酶催化下形成的结构复杂的大分子物质。AGEs可通过糖基化作用直接破坏机体内许多蛋白质的正常结构,还可通过与特异受体RAGE结合,引起下游多条信号通路的改变,产生一系列的生物学效应。目前,在AGE/RAGE信号传导通路相关的下游因子中,以细胞核转录因子(NuclearfactorκB,NF-κB)研究较多。NF-κB是多种“损伤反应基因”的多效转录调节因子,其激活可促使下游损伤因子的表达,导致组织损伤。 本实验用SD(SpragueDawley)大鼠120只,随机分为3组(每组40只,雌雄各半,1个月鼠龄),采用饮水中加氟的方法来复制慢性氟中毒大鼠模型。正常对照组(对照组):自由饮用自来水(自来水含NaF量低于0.5mg/L);低剂量染氟组(低氟组):在自由饮水中加入10mg/LNaF;高剂量染氟组(高氟组):在自由饮水中加入50mg/LNaF;实验期为三个月和六个月。另外,用人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)进行加氟培养,来复制体外染氟神经细胞模型;氟处理浓度为0.4mM/L和4.0mM/L。用形态学检查方法观察大鼠脑组织神经病理学改变;用酶联免疫(ELISA)方法检测大鼠脑组织和培养细胞中AGEs含量;用免疫组织化学方法检测AGEs和RAGE在脑组织中的定位表达;用蛋白印迹和Real-timePCR方法检测大鼠脑组织和细胞模型中AGE/RAGE信号传导通路蛋白和相应的mRNA表达水平;用荧光染色法测定体外培养细胞内的活性氧(Reactiveoxygenspecies,ROS)水平;用流式细胞技术检测细胞的凋亡率;用RAGE阻断剂,维生素C(VitaminC,VitC)和谷胱甘肽(glutathione,GSH)抗氧化剂处理体外培养细胞,检测通路蛋白因子的表达变化、细胞内的活性氧水平和细胞凋亡率。 结果显示,饮水加氟组大鼠毛发无光泽,活动减少,精神萎靡,部分呈现烦躁不安等;染氟组大鼠出现不同程度的氟斑牙、尿氟含量明显高于对照组,其改变程度与染氟剂量和染氟时间呈正相关;染氟大鼠大脑皮质HE染色显示,神经细胞排列轻度紊乱,其余未见明显改变。实验结果表明本实验成功地复制出慢性氟中毒大鼠模型。 酶联免疫检测结果显示,与对照组比较,染氟三个月的两组大鼠脑组织AGEs含量未见明显改变,而染氟六个月时大鼠脑组织AGEs含量明显增高。免疫组化结果显示AGEs定位于细胞间质和胞浆,而RAGE定位于细胞膜上;与对照组比较,染氟三个月的两组大鼠脑组织AGEs和RAGE含量未见明显改变,而染氟六个月时大鼠脑组织AGEs和RAGE含量明显增高。RAGE的蛋白印迹和mRNA表达结果显示,与对照组比较,染氟六个月时大鼠脑组织RAGE蛋白表达和转录水平均增高,与免疫组化结果相一致。细胞染氟24小时后,RAGE表达开始升高,表达增加与染氟时间呈正相关。 蛋白印迹检测结果显示,与对照组相比,实验三个月时高氟组大鼠脑组织中NF-κB增高,而低、高氟组大鼠脑组织中NF-κB的抑制蛋白(inhibitorofNF-κB,IκB)均降低,激酶Ras和肿瘤坏死因子α(Tumornecrosisfactor,TNF-α)表达无变化;实验六个月时低、高氟组大鼠脑组织中激酶Ras、NF-κB和TNF-α表达均明显增高,而低、高氟组中IκB均明显降低。Real-timePCR检测转录水平结果显示,NF-κB和TNF-α的mRNA表达较对照组升高,与蛋白印迹检测结果一致。细胞染氟24小时后,NF-κB表达开始升高,表达增加与染氟时间呈正相关。 实验三个月时,与对照组相比,低、高氟组大鼠脑组织中NADPH氧化酶亚基NOX2(nonphagocyticcelloxidase2,NOX2)蛋白水平表达无变化;实验六个月时低、高氟组大鼠脑组织中NOX2表达均明显增高。Real-timePCR检测转录水平结果显示,NOX2的mRNA表达较对照组升高,与蛋白印迹检测结果一致。细胞染氟12小时后,NOX2表达开始升高,表达增加与染氟时间呈正相关;与对照组比较,染氟培养神经细胞中ROS含量均升高。 蛋白检测结果显示,与对照组相比,低、高氟组大鼠脑组织中B细胞淋巴瘤基因-2(Bcelllymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关x蛋白(Bcl-2accociatedxprotein,Bax)和天冬氨酸蛋白水解酶-3(cysteinylaspartatespecificproteinase,Caspas-3)表达无变化;实验六个月时低、高氟组大鼠脑组织中Caspas-3表达明显增高,Bcl-2表达降低,Bax表达无明显变化;Real-timePCR检测转录水平结果显示,Bcl-2的mRNA表达较对照组降低,Bax的mRNA表达较对照组升高,Caspas-3的mRNA表达无变化。染氟培养神经细胞凋亡率均升高。 用RAGE阻断剂和抗氧化剂加氟处理细胞后,可不同程度抑制高氟引起的NF-κB、NOX2的蛋白表达升高,降低染氟细胞的凋亡率和ROS水平,差异有统计学意义。 综上所述,慢性氟中毒可激活AGE/RAGE信号转导通路,引起该通路下游激酶Ras、NF-κB、NOX2等因子的激活,导致氧化应激水平升高,可能促进炎症因子释放,造成神经细胞损伤;AGE/RAGE信号转导通路的改变还可能激发神经细胞凋亡的过程。采用RAGE阻断剂和抗氧化剂处理后,可明显抑制氟引起的下游NF-κB和NOX2激活,同时下调神经细胞凋亡率和氧化应激水平。研究结果表明,AGE/RAGE信号转导通路改变在慢性氟中毒神经损伤发生机制中可能发挥重要作用。