论文部分内容阅读
乳腺癌已经在世界范围内成为导致女性人群死亡的主要因素,而肿瘤细胞的侵袭转移是乳腺癌致死的重要原因。肿瘤细胞的侵袭转移过程由多个步骤构成,其中基质金属蛋白酶(matrix metalloproteases, MMPs)降解细胞外基质在肿瘤细胞侵袭转移的过程中发挥了重要作用。体内和体外实验证据表明RECK蛋白可以通过负向调控MMP2和MMP9的功能进而抑制肿瘤细胞的侵袭转移,而且在肿瘤进展过程中,RECK蛋白表达减少甚至丢失,因此在肿瘤细胞中恢复RECK蛋白的表达对于抑制肿瘤细胞的侵袭转移至关重要。异甘草素是从中草药甘草中提取的一种植物化学物,目前已发现其具有抗炎和抗氧化等功能,但目前关于其能否通过上调肿瘤抑制基因RECK的表达抑制肿瘤细胞的侵袭转移尚未有报道。目的：本研究以人三阴乳腺癌细胞系Hs-578T和MDA-MB-231为研究对象,探讨异甘草素抑制乳腺癌细胞侵袭转移的机制及RECK蛋白在其中的作用,从而为肿瘤的膳食干预提供更多的实验依据。方法：采用MTT实验检测细胞活力；采用预先铺好matrigel的Transwell实验检测乳腺癌细胞的侵袭能力；采用明胶酶谱实验检测MMP2和MMP9的活性；采用RT-PCR和实时定量PCR实验检测基因的mRNA水平；采用实时定量PCR实验检测miR-21的表达水平；采用蛋白质印迹实验检测基因的蛋白水平；采用染色质免疫共沉淀实验检测stat3在miR-21启动子区域的结合丰度：采用细胞瞬时转染实验敲除RECK和PIAS3、高表达或低表达miR-21。结果：(1)异甘草素能够抑制乳腺癌MDA-MB-231和Hs-578T细胞的侵袭能力：首先,采用MTT实验结果发现20.0和10.0μM分别是异甘草素处理乳腺癌细胞24和48小时不影响细胞活力的最高浓度；采用Transwell实验证实异甘草素能够在不影响细胞活力的前提下,下调乳腺癌细胞的侵袭能力；采用RT-PCR实验发现异甘草素可以呈剂量依赖性和时间依赖性地下调乳腺癌细胞内MMP9的mRNA,但MMP2的mRNA并未受影响;采用明胶酶谱实验发现异甘草素可以下调MMP9的活性,同样,MMP2的活性未受影响。(2)异甘草素通过上调RECK的蛋白水平抑制MMP9:机制研究证据指出乳腺癌细胞经过异甘草素处理后RECK的蛋白水平上调,其mRNA水平未发生改变,而当使用RECK siRNA干扰异甘草素诱导的RECK蛋白高表达后,异甘草素对细胞内MMP9表达、活性及细胞侵袭能力的抑制作用被逆转。(3)异甘草素通过抑制miR-21上调RECK的蛋白表达：实时定量PCR实验发现异甘草素可以呈剂量依赖性和时间依赖性地下调两株乳腺癌细胞中miR-21的表达,并且当使用特异性抑制剂干扰细胞内miR-21的表达后,RECK的蛋白水平上调,mRNA未受影响。当在异甘草素处理的细胞中重新高表达miR-21后,异甘草素对RECK的诱导作用被抵消,并且细胞的侵袭能力也有一定的恢复。(4)异甘草素下调stat3在miR-21启动子区域的结合丰度：染色质免疫共沉淀实验及蛋白质印迹实验结果证实异甘草素在磷酸化后水平降低转录因子stat3在miR-21启动子区域的结合丰度。(5)异甘草素通过上调PIAS3表达影响stat3在miR-21启动子区域的结合丰度：蛋白质印迹实验发现stat3的特异性抑制分子PIAS3在经过异甘草素处理的乳腺癌细胞中表达上调,当使用PIAS3 siRNA干扰异甘草素诱导的PIAS3高表达后,stat3在miR-21启动子区域结合丰度及miR-21的表达得到部分恢复。结论：在人三阴乳腺癌细胞系中,异甘草素通过上调PIAS3的表达在磷酸化后水平影响stat3的DNA结合能力,下调stat3在miR-21启动子区域的结合丰度,下调miR-21的表达进而使RECK蛋白表达升高,降低MMP9的转录水平和活性,使乳腺癌细胞降解细胞外基质的能力下降,最终负向调控细胞的侵袭能力。