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重组抗菌肽是一类利用基因工程的方法生产的小分子多肽,具有分子量小、热稳定好、广谱抗菌活性,被认为是解决病原微生物对抗生素不断增强的抗性问题的很好选择。水产动物的养殖特点决定了该类物质的应用一般只能进行口服给药,由于蛋白类药物普遍存在半衰期短、易被体内酶降解等问题,在口服给药体系中受到极大的限制,人们通常采用可以对药物进行控/缓释作用的微胶囊化技术解决上述问题。
本研究对重组表达的对虾素3-2进行亲和层析纯化,以海藻酸钠为壁材,采用凝聚法制备了重组抗菌肽-海藻酸钠微囊,以微囊的形态和包封率为指标优化制备工艺,对制备的微囊进行体外释放特征的初步研究。结果显示,在氯化钙浓度为1.5％,海藻酸钠浓度为2.0%时,制备的微囊为完整的球形,冷冻干燥后的直径约为1.1mm,包封率为83.87%。微囊在模拟胃液(pH2.0)中2h左右释放量趋于稳定,释放量低于14%;微囊在模拟肠液(pH7.8)中不断释放,5h时释放量达98%,表明微囊具有良好的肠溶性而可以抵抗胃液的破坏,可以用作重组抗菌肽缓释/控释制剂,为抗菌肽在水产病害防治过程的口服给药提供实验基础。
将制备的重组抗菌肽-海藻酸钠微囊口服给药罗非鱼,另设特异性饲料组和空白对照组,连续投喂20d后取其肝脏、胃、肠道、血清和肌肉组织,利用Western Blot技术检测样品中是否含有重组抗菌肽。结果发现,空白对照组各样品均未检测到目的蛋白,而特异性饲料组和海藻酸钠微囊组也未发现重组抗菌肽。重组抗菌肽的口服导入及检测技术还有待于深入研究。
以纯化的重组抗菌肽为模型蛋白,乳酸/羟乙酸共聚物(PLGA)为载体,采用复乳溶剂挥发法制备重组抗菌肽-PLGA微球,通过正交化设计法对微球制备的7种因素进行优化,以粒径、包封率及24h释放率为观察指标。结果发现,在重组抗菌肽的浓度为10mg,PLGA用量200mg,PVA浓度为1%,初乳超声功率100W,复乳超声功率为100W,PEG用量为5%,氯化钠的浓度为5%的条件下制备的重组抗菌肽-PLGA微球,SEM下具有光滑的表面且形态规整,大部分微球粒径集中在3μ m左右,但微囊的包封率都比较低。