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目的:20世纪以来,人口陡增,自然资源过度开采造成野生药用资源短缺,栽培药材成为商品主要来源。药材质量与环境密切相关,药材栽培也导致药材质量下降。提高栽培药材质量是中药资源学研究重点与难点,急需寻找一种有效方法提高药材质量。课题组前期对黄芩药材进行了较深入的质量调控研究,采用活性氧（ROS）再现逆境条件,调控黄芩植株和黄芩鲜根的生理代谢,增加了次生代谢产物的含量。植物细胞具有全能性和完整代谢单元,采用ROS直接调控黄芩悬浮细胞,能更清晰阐明ROS调控次生代谢机制,且细胞悬浮培养不受季节的影响,可实现工厂化高效生产药用次生代谢产物,为中药资源开发提供新途径。方法:通过组织培养技术诱导黄芩悬浮细胞,采用PEG-6000模拟干旱、外源H2O2和活性氧O2-.载体Na2S2O4模拟生态因子,研究上述处理对黄芩悬浮细胞ROS含量、次级代谢的影响,以及黄芩悬浮细胞中ROS含量、抗氧化酶活性、黄酮类成分合成关键酶活性及基因表达、黄酮类次生代谢物之间的显著性和关联性。结合UPLC-Triple TOF-MS/MS代谢组学技术,阐明其代谢变化机制及黄芩药材质量形成机理。酶活性测定及物质含量采用分光光度法和高效液相色谱法。结果:1.黄芩悬浮细胞诱导与优化最佳条件（1）诱导黄芩愈伤组织最佳条件:黄芩幼苗带节茎段为外植体,MS添加1.0mg/L2,4-D+1.0 mg/L6-BA,黄芩愈伤组织诱导率88.00%,呈淡黄色疏松颗粒状,有光泽。21 d进行继代培养。（2）诱导黄芩悬浮细胞最佳条件:黄芩愈伤组织为诱导材料,MS液体培养基添加0.2 mg/L2,4-D+1.0 mg/L6-BA,接种量3.0 g/瓶,蔗糖浓度3%,pH 5.8,25士1℃,120 r/min悬浮培养,12 d进行继代培养。2.PEG模拟干旱对黄芩悬浮细胞代谢的影响（1）活性氧含量影响:PEG处理组O2-.含量均显著高于对照组,且与PEG浓度呈正比。4%PEG处理组H2O2含量与对照组无明显差异,8%PEG和16%PEG处理组H2O2含量低于对照组。（2）抗氧化酶系统影响:PEG处理组在培养前48 h内SOD活性高于对照组。PEG处理组CAT活性均高于对照组。4%、8%PEG处理组POD活性显著高于对照组。4%PEG处理组APX活性第60 h时比对照组提高了3.35倍。（3）次生代谢产物含量影响:4%、8%、16%PEG处理组PAL活性在12-24h内活性分别提高11.60%、23.93%、14.92%,促进了黄酮类成分的合成和积累。4%PEG处理24 h,黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素含量分别比对照组提高了17.51%%、2.71%、93.00%、64.29%,尤以苷元类成分最为显著。（4）显著性和相关性分析:4%PEG处理组,汉黄芩素含量分别与O2-.、黄芩苷、黄芩素含量呈显著性正相关。8%PEG处理组,H2O2含量分别于O2-.、黄芩素含量呈显著性负相关;O2-.含量与黄芩素、汉黄芩素含量及POD活性呈显著性正相关。16%PEG处理组,CAT活性分别与PAL活性、黄芩苷含量呈显著性正相关。相关性表明ROS、抗氧化酶、黄酮类化合物处于动态平衡中,抗氧化酶和黄酮类化合物协同消除多余的ROS。3.外源H2O2对黄芩悬浮细胞代谢的影响（1）活性氧含量影响:外源H2O2处理黄芩悬浮细胞,O2-.含量除24-48 h外均显著高于对照组;H2O2含量均显著高于对照组,0-48 h内H2O2含量与外源H2O2浓度呈正比。（2）抗氧化酶系统影响:中低浓度外源H2O2处理黄芩悬浮细胞,SOD、CAT、POD、APX抗氧化酶活性提高显著。（3）次生代谢产物含量影响:10μmol/L、0.1μmol/L、0.001μmol/L外源H2O2处理组PAL活性在24 h分别提高6.08倍、2.54倍、12.23倍（P<0.05）,促进了黄酮类成分的合成和积累。0.1μmol/L外源H2O2处理72 h,黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素含量分别比对照组提高了2.64%%、22.41%、43.19%、115.65%。（4）显著性和相关性分析:10μmol/L外源H2O2处理组,H2O2含量与黄芩苷、黄芩素含量及APX活性呈显著性负相关;SOD活性与汉黄芩苷含量呈显著性正相关。0.1μmol/L外源H2O2处理组,SOD活性与O2-.含量及汉黄芩苷含量、CAT活性与PAL活性、黄芩苷含量与汉黄芩苷含量、黄芩素含量与汉黄芩素含量均呈显著性正相关。0.001μmol/L外源H2O2处理组,SOD活性与CAT活性及汉黄芩苷含量、黄芩素含量与汉黄芩素含量呈显著性正相关。相关性表明ROS、抗氧化酶、黄酮类化合物处于动态平衡中,抗氧化酶和黄酮类化合物协同消除多余的ROS。4.Na2S2O4对黄芩悬浮细胞代谢的影响（1）活性氧含量影响:Na2S2O4处理组O2-.含量均显著高于对照组,且与Na2S2O4浓度呈正比。低浓度Na2S2O4处理组H2O2含量显著提高。（2）抗氧化酶系统影响:Na2S2O4处理组SOD、CAT、APX活性均高于对照组。10μmol/L、0.1μmol/L Na2S2O4处理组POD活性显著高于对照组。（3）次生代谢产物含量影响:10μmol/L、0.1μmol/L、0.001μmol/L外源Na2S2O4处理组PAL活性在第12 h、12 h、48 h分别比对照组提高了22.60%、24.89%、26.66%,促进了黄酮类成分的合成和积累,0.001μmol/L Na2S2O4处理24h,黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素含量分别比对照组提高了22.54%%、33.76%、97.75%。（4）显著性和相关性分析:10μmol/L Na2S2O4处理组,SOD活性分别与PAL活性和黄芩苷含量、POD活性分别与APX活性和PAL活性、APX活性与PAL活性均呈显著性正相关。0.1μmol/L外源Na2S2O4处理组,POD活性分别与PAL活性、黄芩苷含量呈显著性正相关。0.001μmol/L外源Na2S2O4处理组,POD活性与汉黄芩苷含量呈显著性负相关;O2-.含量分别与汉黄芩苷含量和黄芩素含量、H2O2含量分别与PAL活性和黄芩苷含量、PAL活性分别与SOD活性和黄芩苷含量、CAT活性与APX活性、均呈显著性正相关。相关性表明:PAL活性与黄酮类成分强相关,说明ROS可增强PAL活性,从而促进了黄酮类化合物的合成和积累。同时表明抗氧化酶和黄酮类化合物协同消除多余的ROS。5.PEG模拟干旱对黄芩悬浮细胞的代谢组学研究应用UPLC-Triple TOF-MS/MS分析技术,建立了黄芩悬浮细胞代谢图谱,共鉴定出21种化学成分。建立了PEG模拟干旱与正常培养的黄芩悬浮细胞化学成分轮廓,鉴定出9个差异性成分,分别是莽草酸、柠檬酸、白杨素、3,5,7,2’,6’-五羟基黄烷酮、圣草酚、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素,其化学结构显示大多含游离的酚羟基或甲氧基黄酮,具有很高的抗氧化活性。结果表明,PEG模拟干旱时,柠檬酸含量降低,莽草酸含量增加,表明次生代谢增强。ROS过多时,黄芩素、汉黄芩素、3,5,7,2’,6’-五羟基黄烷酮、圣草酚等抗氧化活性较强的苷元和游离的酚羟基或甲氧基黄酮含量较高,反之ROS含量降低时,这些苷元转化成抗氧化活性低的相应苷储存起来,游离的酚羟基或甲氧基黄酮类含量随之降低,通过这些黄酮类化合物之间的生物合成和转化,类似于复杂的缓冲溶液,保持了植物体内ROS的平衡,阐明了药材质量形成的机制,同时很好的解释了药用植物成分多样性、复杂性及它们的生态学意义。结论:PEG-6000模拟干旱、外源H2O2和活性氧O2-.载体Na2S2O4模拟生态因子,处理黄芩悬浮细胞后,细胞内O2-.和H2O2含量显著提高,激活了抗氧化酶防御系统,不同程度提高了SOD、CAT、POD、APX的活性,增强了黄芩悬浮细胞次生代谢产物合成和积累,抗氧化酶系统和次生代谢产物协同消除多余的ROS。适度ROS再现逆境条件处理黄芩悬浮细胞,可以达到调控细胞代谢,提高次生代谢产物的目的。