【摘 要】
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该试验合成了盐酸克仑特罗人工抗原,制备出抗盐酸克仑特罗的单克隆抗体,建立了检测盐酸克仑特罗的间接竞争ELISA方法,用纯化后的单抗制备出亲和层析柱并对柱效进行了初步测试
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该试验合成了盐酸克仑特罗人工抗原,制备出抗盐酸克仑特罗的单克隆抗体,建立了检测盐酸克仑特罗的间接竞争ELISA方法,用纯化后的单抗制备出亲和层析柱并对柱效进行了初步测试.采用重氮化法将盐酸克仑特罗与牛血清蛋白(BSA)和鸡卵清白蛋白(OVA)交联,分别合成出免疫原和包被原,紫外扫描法确认交联成功.取9只健康6周龄雌性BaLb/C小鼠,腹腔注射免疫原与弗氏佐剂的混合物,选择抗血清效价在1:100000以上的小鼠进行融合.用PEG4000融合细胞,有限稀释法进行克隆化,筛选到能稳定分泌特异性抗体的细胞株7F<,11>和7H<,6>.采用7F<,11>细胞株,用低血清培养法制备上清并浓缩,常规方法制备腹水,分别用硫酸铵沉淀法和辛酸-硫酸铵沉淀法进行纯化.ELISA法测定纯化后7F<,11>腹水中抗体效价为1:25600,纯化后浓缩上清中抗体效价为1:12800~25600,亲和常数为8.6×10<7>L/mol.琼脂糖免疫沉淀法测定单抗亚型为IgG<,1>.SDS-PAGE电泳结果显示腹水中抗体分为重链与轻链两条带,上清中尚有少量杂蛋白.用7F<,11>上清中抗体建立了间接竞争ELISA方法.抑制曲线的线性回归方程为:Y=-39.28X+95.62(n=5),相关系数为-0.9921,线性范围为0.82~100ng/mL.方法的IC<,50>为14.5ng/mL,LOD为0.82ng/mL.单抗对莱克多巴胺的交叉反应率为1.73%,对肾上腺素、异丙肾上腺素、去甲肾上腺素、青霉素、恩诺沙星、BSA和OVA等均无交叉反应.方法的批内变异系数为6.5%,批间变异系数为19.6%.用纯化后的上清抗体先后制备出四根亲和层析柱Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ.主要柱参数为:抗体交联率96.70%、93.16%、89.13%、89.13%;蛋白载量3.12、5.76、8.33、8.33mg/mL;最大柱容量583.0、1036.0、963.8、954.3ng.优化后的洗脱条件为5mL甲醇,在自然重力下洗脱.高效液相测得500ng、200ng、50ng剂量组的尿样添加回收率分别为65.9%、67.2%、51.7%,变异系数分别为5.8%、8.4%、12.0%.
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