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背景：树突状细胞( Dendritic cells DC)是目前所知体内功能最强的专职抗原递呈细胞(Antigen presenting cells APC),也是目前发现的唯一能激活未致敏性T细胞的专职抗原递呈细胞。它能高效地摄取,加工处理和递呈抗原,未成熟DC具有较强的迁移能力,而成熟的DC能有效激活初始型T细胞,是启动,调控,并维持免疫应答的中心环节。成熟DC能表达高水平的抗原递呈分子(MHC-I和MHC-II),共刺激因子(CD40,CD80和CD86),自身也具有高分泌IL-12的能力。DC与肿瘤的发生,发展有着密切的关系,有效的抗肿瘤免疫反应的核心是产生以CD8+T细胞为主体的细胞免疫应答,是DC作为免疫治疗手段的基础。 小鼠淋巴组织中CD8α树突状细胞含有至少三种不同的亚型:CD8+CD4-,CD8-CD4-,CD8-CD4+。其中表达CD8α表面分子的亚型称为CD8α+树突状细胞(简称8+DC),反之称为CD8α-树突状细胞(简称8-DC)。8+DC主要存在于动脉周围淋巴鞘中(PALS),而8-DC则存在其边缘区域。这两类亚型都含有CD11c,MHC-I, MHC-II;其中8+DC的表面抗原含有DEC-205,CD8α,CD103;8-DC的表现型为CD11b+CD8α-DEC-205-CD4+Mac-1+。8+DC与其相邻的8-DC相比有多个主要功能上的区别:①它们能有效地将外源细胞产生的抗原和可溶性抗原交叉递呈给主要组织相容性复合体 I(MHC-I);②激活后它们是白细胞介素-12(IL-12)的主要产生细胞,进而刺激炎症反应;③在细胞内病原体感染时,它们成为主要的病原体抗原递呈者,促进针对入侵病原体的CD8+T细胞反应;④在稳定状态,它们具有免疫调节性能,并帮助维持对自身组织的免疫耐受;⑤8+DC可诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的生成而8-DC则不可以, CD8 CLT则在抗肿瘤,HIV/AIDS等方面起到重要的作用。所以小鼠8+DC是调节T细胞反应的重要角色,但存在的问题是无法在人体内找到其对应的细胞。法国科学家2010年报道,表达DNGR-1(CLEC9A)和高表达BDCA3分子的人脾脏DC在表型与功能方面与小鼠8+DC相似(DNGR-1BDCA3hiDCs)。而且该细胞可以在体外增殖,这为8+DC的免疫治疗打开了一扇门。 为探索8+DC与8-DC在表达功能区域的差异基因有哪些。通过减数抑制杂交技术(Suppressive subtractive hybridization;SSH)筛选这两种亚型的优先表现型基因。SSH法能够通过特殊的专利技术,首先消除掉8+DC细胞上与8-DC相同的基因,富集8+DC特异基因,建立一个包含有8+DC全部特异表达基因的cDNA文库。该文库称为减数cDNA文库。之后从该文库中可以克隆出在8+DC高表达,但在8-DC低表达或者不表达的基因。在表达的8+DC新基因中,有些是未知的新基因序列,有些是已知的基因序列。发现55种新基因和11种尚未入选基因库的基因,其中14种基因差异表达显著。 在这些表达差异明显的特异性表现型基因中, PCNP( PEST-containing nuclear protein)是一种新近发现的含有PEST序列的核蛋白, PCNP于2004年由日本科学家首次侧面报道,而且仅仅作为泛素连接酶NIRF(Np95/ICBP90-like RING figer protein)的底物共同研究报道。NIRF包含类泛素化区域(a ubiquitin-like domain),PHD区域(a PHD finger),YDG/SRA区域(a YDG/SRA domain)和指环状区域(a RING finger)并且发现NIRF在正常细胞增殖期间呈现高表达,在G0/G1期间低表达。同时发现在肿瘤细胞例如HT-1080,HepG2中呈现持续性高表达。NIRF本身具有自动泛素化的活性,这是泛素连接酶的特点。而泛素依赖性蛋白的降解可以调节多种细胞过程,包括细胞周期进程,DNA损伤,变异和蛋白的运输。泛素连接酶与被降解蛋白的特异性底物结合,影响泛素化反应的效率。PCNP在293和COS-7细胞中会很容易被泛素化,在体内或体外NIRF都可以把PCNP泛素化,NIRF与细胞周期的调控有关,这就表明NIRF是一种泛素化连接酶,而PCNP正是它的底物。它们可能共同组成了一个与细胞增殖有关的信号通路,与此同时NIRF在9p23-24.1段的基因在众多类型的肿瘤细胞的基因中都频繁出现,因此PCNP和NIRF可能与肿瘤发生也有一定的关系。 树突状细胞作为免疫系统的重要组成部分,在1973年被发现后对于它的研究一直是免疫学甚至整个生命科学领域的重点内容。随着研究的进展,我们已经初步了解树突状细胞的分布,来源和功能。伴随研究的深入,对树突状细胞的亚型分类也有了更为细致的分化和总结。 我们发现关于PCNP的系统深入研究依旧缺乏,也产生了很多疑问;作为一种含有PEST序列的核蛋白,PCNP在细胞核内起到什么样的作用?PEST序列广泛存在短寿命蛋白中,促进细胞凋亡和调控细胞周期。那么是否对淋巴系CD8α亚型树突状细胞也具有同样的作用?PCNP和NIRF共同作为一种信号转导通路,这种信号通路处于细胞信号通路体系的何处,并且是否对细胞增殖起到决定性影响?而作为研究的核心CD8α+树突状细胞,PCNP对其机制,功能的影响譬如信号通路,细胞周期,凋亡作用,吞噬作用,抗原递呈功能等则更具有重大意义。假定新基因PCNP在树突状细胞中具有调控生长周期,激活初始T细胞,诱导特异性CTL,甚至可影响抗原递呈功能,那么这种新基因就为治愈免疫性疾病例如艾滋病和提高肿瘤患者的免疫能力提供了可靠有效的理论支持,并且可能为治疗开辟全新的途径。 目的:本实验通过基因重组技术,设计出特异性新基因PCNP的过表达和沉默发卡结构引物序列,之后将二种不同序列通过不同途径转染到DC2.4中,研究树突状细胞功能性变化例如周期,凋亡和对其他信号通路的影响。 方法:应用pubmed等软件技术设计出特异性新基因PCNP的过表达和沉默发卡结构引物序列。通过RT-PCR检测引物序列大小,BLAST对比引物序列的吻合度,定量PCR检测PCNP在细胞中的基因表达量的差异,通过WB技术检测PCNP在细胞中相应蛋白表达量的差异;利用流式细胞术检测细胞凋亡,生长周期的差异,通过MTT实验检测对细胞增殖的影响。 结果: 1.成功设计PCNP过表达和沉默引物序列。 2.PCNP过表达全长基因成功转化到真核表达载体pcDNA3.1(+)中3, PCNP沉默基因成功转化到真核表达载体pSilencer4.1-CMV neo中4, PCNP过表达和沉默质粒成功转染到DC2.4中,并表达相应蛋白5,成功使用MTT测定细胞生长周期的差异6,成功通过流式细胞术测定细胞增殖周期的差异。 结论:我们成功构建了PCNP过表达和沉默真核表达质粒,并成功转染进DC2.4中。研究发现PCNP siRNA沉默质粒可抑制树突状细胞生长和抑制细胞G1期和S期的增殖,说明PCNP可有效调控树突状细胞的功能。为进一步研究对树突状细胞其他信号通、抗原递呈、激活初始T细胞等功能奠定了基础。