丙烯醛单克隆抗体的制备以及ELISA方法的建立

• 作 者: 吕哲
• 出 处: 暨南大学
• 发表日期: 2004年期
• 关键词: 丙烯醛（Acrolein） 单克隆抗体 间接竞争ELISA

目的：利用丙烯醛阳性杂交瘤细胞株制备腹水型单克隆抗体，优化并建立丙烯醛的ELISA检测技术。方法：采用直接法人工合成丙烯醛完全抗原。选择6-8周龄的BALB/c雌性小鼠进行免疫，免疫5次后即可获得较高的免疫效价。利用PEG法将免疫效价高的BALB/c小鼠的脾脏细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，采用有限稀释法进行四次亚克隆，筛选得到一株能稳定分泌抗丙烯醛的抗体的亚型为IgG2b的杂交瘤细胞株1G7G6，并制备腹水型抗体。在此基础上，通过对包被缓冲液、包被条件、封闭液、封闭时间、体系反应时间等因素的筛选比较，优化并建立检测丙烯醛的间接竞争ELISA方法。结果：合成适于ELISA检测的完全抗原Acrolein-KLH（免疫原）和Acrolein-BSA（包被原），制备的丙烯醛抗体(腹水)的效价均在8×104以上，与其他丙烯醛类似物交叉反应率均小于0.1%，特异性高。筛选得到的ELISA最佳条件为：0.05M pH9.6CBS溶液作为抗原包被缓冲液在4℃下包被16h；5%脱脂奶粉作为封闭液37℃下封闭1h；PBST作为工作缓冲液稀释一抗和二抗均反应1h；TMB显色10min测定OD值。优化后丙烯醛ELISA方法的检测灵敏度（IC50）为43.2ng/mL，检测线性范围为4.4‐417.2ng/mL，检测限（LOD）为1.8ng/mL。结论：通过制备完全抗原进行动物免疫、细胞融合、间接ELISA和竞争ELISA联合的筛选方法以及细胞克隆化等技术成功制备得到高亲和力、高效价的丙烯醛腹水型单抗，筛选优化了间接竞争ELISA检测条件。国内外首次建立了检测液相中丙烯醛的特异、快速、灵敏的ELISA检测技术。