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肺纤维化(Pulmonary fibrosis,PF)是一种由多种因素引起的以弥漫性肺泡炎和肺泡结构紊乱最终导致肺间质纤维化为特征的疾病。该病的主要病理特点是早期以下呼吸道急性炎症反应为主,并伴随着大量成纤维细胞病理性增生转型,导致后期某些细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)成分在肺泡和间质内沉积,纤维组织过度修复造成肺组织结构的紊乱、肺泡损伤、胶原沉积,最终导致肺纤维化。随着工业化的发展,肺纤维化发病率呈逐年上升趋势,因其缺乏有效的治疗手段,预后差、死亡率高,严重危害人类健康与生命。肺纤维化的发病机制欠清晰,其中炎症反应、免疫反应和胶原沉积是对肺纤维化发病机理的重要诠释。目前临床上以糖皮质激素和免疫抑制剂治疗为主,但只能在一定程度上缓解某些症状,不能从根本上逆转和治疗,也不能防御肺纤维化,并有不同程度的毒副作用。对于肺纤维化,中医药以其丰富的临床用药经验以及多成分、多靶点、多通路治疗手段为特点,近年来受到了国内外学者的重视。复方芒果叶(Compound mango leaves,CML)干膏系广西终身教授、名中医邓家刚主任医师根据多年临床经验拟定的治疗肺纤疾患的复方。本研究以复方芒果叶干膏为研究对象,采用博莱霉素(Bleomycin,BLM)介导的肺纤维化动物模型对其相关病理学、细胞因子、差异蛋白等进行药效与机制的探讨,并利用细胞炎症模型筛选复方芒果叶干膏有效抗炎物质及研究复方对肺纤维化相关的炎症通路的作用。主要研究内容和结果如下:1、复方芒果叶干膏抗肺纤维化药效研究:运用BLM气管注射法建立小鼠肺纤维化模型,观察小鼠的整体情况、病理表现以及检测肺组织中羟脯氨酸(Hydroxyproline,HYP)、相关细胞炎症因子、相关抗氧化应激因子的表达水平,从体内水平上对复方芒果叶干膏抗炎、抗氧化以及抗纤维化药效进行评价。结果显示,复方芒果叶干膏高剂量组小鼠呼吸逐渐平稳、活泼好动、毛色整齐有光泽、进食正常、体重逐渐上升,中、低剂量组均有好转。另外,复方芒果叶干膏高、中、低剂量组小鼠肺组织的肺指数均显著性降低(P<0.001)。以上提示:复方芒果叶干膏从整体水平上对肺纤维化小鼠的状态和肺组织具有保护作用。病理观察发现,苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-eosin staining,HE)观察模型组肺组织结构破坏严重,损伤分布较广,部分支气管腔和肺泡腔内可见大量炎性渗出物,中度至重度肺泡炎伴纤维组织增生及纤维化致肺实变,给药组肺组织结构清晰、形态正常,肺泡炎和肺纤维化明显减少,未见弥漫性的炎症和纤维化,肺泡间隔增厚不明显。Masson染色可见高剂量组的纤维化程度明显减少,中、低剂量组纤维化程度亦相应减少。另外Szapiel评分结果显示复方芒果叶干膏高、中、低剂量组小鼠肺组织的肺泡炎程度均显著性降低(P<0.001),Ashcroft评分结果显示复方芒果叶干膏高、中剂量组小鼠肺组织的纤维化程度均显著性降低(P<0.001)。此外,经过药物干预后,复方芒果叶干膏高、中、低剂量组小鼠肺组织中HYP含量显著性降低(P<0.001)。以上提示:复方芒果叶干膏具有保护肺组织,明显降低肺泡炎、胶原沉积以及肺纤维化的作用。抗炎和抗氧化研究作用发现,复方芒果叶干膏高剂量组小鼠肺组织中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量均显著性降低(P<0.001或P<0.01);中剂量组小鼠肺组织中IL-6、TNF-α的含量均显著性降低(P<0.001或P<0.05)。复方芒果叶干膏高、中、低剂量组小鼠肺组织中丙二醛(Malondialdehyde,MDA)水平显著性降低(P<0.001),超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、总抗氧化能力(Total antioxidant capacity,T-AOC)水平均显著性升高(P<0.001或P<0.01或P<0.05);高、中剂量组小鼠肺组织中还原型谷胱甘肽(Reduced glutathione,GSH)水平显著性升高(P<0.001)。结果提示:复方芒果叶干膏对肺纤维化具有良好的抗炎和抗氧化作用。2、复方芒果叶干膏抗肺纤维化机制研究:运用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantification,i TRAQ)蛋白组学技术对肺纤维化小鼠肺组织进行差异蛋白的定量分析,通过基因本体论(Gene Ontology,GO)、蛋白相邻类的聚簇(Cluster of Orthologous Groups of proteins,COG)、Pathway等功能注释以及富集分析来对复方芒果叶干膏抗肺纤维化的机制进行研究。研究结果显示,参与复方芒果叶干膏治疗肺纤维化的差异蛋白有1700多个,存在于细胞外区、细胞外间隙、细胞外基质、细胞膜、核小体等细胞组分,具有肽酶调节活性、酶活抑制、分子结构活性、钙离子结合等分子功能,并参与防御反应、炎症反应、免疫反应、凝血系统调节等生物过程。复方芒果叶治疗肺纤维化的机制可能是通过影响Itgb1、FGF1等73个主要差异蛋白分别作用于PI3K-Akt、Focal adhesion等26条通路发挥作用,并分别与炎症反应、免疫反应、细胞外基质沉积、肌肉收缩以及氧化应激等生物过程相关。以上提示:肺纤维化的发病机制是一个多靶点蛋白、多信号转导通路、多生物功能因素共同构建的复杂生物过程。复方芒果叶可能从抗炎、调节免疫、减少细胞外基质沉积、缓解肌肉收缩以及抗氧化等生物功能方面对肺纤维化进行治疗。3、复方芒果叶干膏化学物质组研究:本研究采用超高效液相联用四级杆串联飞行时间质谱(Ultra-high Performance Liquid Chromatography-Quadrupole-Time-ofFlight/Mass Spectrometry,UPLC-Q-TOF/MS)分析技术,根据全扫描质谱图一级质谱中测定得到的准分子离子峰,结合二级质谱中的碎片信息分析这些化合物的质谱裂解特征,并推测化合物可能的结构式,以此对复方芒果叶干膏的整体化学物质基础进行研究。本研究表征分析出48个化学成分,其中皂苷类化合物26个,二苯甲酮类化合物10个,黄酮类化合物3个,酚酸类化合物5个,蒽醌类化合物3个,香豆素类化合物1个。4、复方芒果叶干膏抗炎物质筛选研究及机制预测:本研究利用肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)诱导人支气管上皮细胞BEAS-2B细胞炎症模型和建立UPLC/Q-TOF结合双荧光素酶报告基因系统的筛选核转录因子-κB(Nuclear transcription factor-κB,NF-κB)抑制剂的分析方法,从细胞水平上对复方芒果叶干膏的抗炎活性成分进行筛选鉴定。利用Pharm Mapper、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)等生物信息手段对鉴定出的抗炎物质进行网络药理学研究,预测分析其靶点蛋白和作用通路。最后运用双荧光素酶和酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)等检测方法对抗炎成分芒果苷、补骨脂素、人参皂苷Rg1进行活性验证和协同作用研究。结果显示,复方芒果叶干膏共筛选出16个抗炎成分,包括鸢尾酮酚-3-C-β-D-葡萄糖苷、没食子酸甲酯、芒果苷、鸢尾酮酚-3-C-(2-O-没食子酰基)-β-D-葡萄糖苷、2,4’,6-三羟基-4-甲氧基苯甲酮-3-C-β-D-吡喃葡萄糖苷、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、补骨脂素、大黄素甲醚、三七皂苷R2、人参皂苷Rg2、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rc、甲基异茜草素-1-甲醚、三七皂苷K。16个抗炎成分分别通过HRAS、MAP2K1等40个靶点作用于炎症反应相关的MAPK、Focal adhesion等11条通路,其中与复方芒果叶干膏关联性比较高的抗炎通路为MAPK、Focal adhesion、VEGF等通路。以上提示:复方芒果叶干膏是通过多成分、多靶点、多通路来发挥其抗炎作用。选择MAPK通路进行进一步研究,网络药理图显示,芒果苷(Mangiferin)、补骨脂素(Psoralen)、人参皂苷Rg1(Ginsenoside Rg1)三个化合物与MAPK通路相关,其中芒果苷作用于HRAS、FGFR1;人参皂苷Rg1作用于MAP2K1、BRAF,补骨脂素作用于MAP2K1、FGFR1。活性验证研究显示,芒果苷、补骨脂素、人参皂苷Rg1可显著性降低细胞中NF-κB、白细胞介素(IL)-6、IL-8的表达水平(P<0.001或P<0.01或P<0.05)。结果提示:芒果苷、补骨脂素、人参皂苷Rg1可分别通过MAPK通路发挥其炎症抑制作用。协同增效作用研究显示,芒果苷与人参皂苷Rg1协同作用后NF-κB表达水平明显低于芒果苷或人参皂苷Rg1单独给药(P<0.01);芒果苷与补骨脂素协同作用后IL-6表达水平明显低于芒果苷单独给药(P<0.01);补骨脂素与人参皂苷Rg1协同作用后NF-κB、IL-6、IL-8表达水平明显低于补骨脂素或人参皂苷Rg1单独给药(P<0.001或P<0.01或P<0.05)。结果提示:芒果苷、补骨脂素、人参皂苷Rg1具有良好的协同抗炎作用。总结:本文首先从整体动物水平上初步证明复方芒果叶干膏具有保护肺组织损伤、抗肺纤维化的作用,其中抑制胶原沉积、抗炎和抗氧化均可能是其发挥药效的作用机制。其次从蛋白水平上阐释复方芒果叶干膏通过多靶点、多通路、多因素发挥治疗肺纤维化的生物学机制,其中抗炎信号通路与治疗肺纤维化关联性最大。再次利用UPLC-Q-TOF/MS分析技术对复方芒果叶干膏进行化学成分表征分析。然后从细胞水平上阐明了复方芒果叶干膏的抗炎物质基础,证明其所含的成分具有“协同所用”。最后,复方芒果叶干膏“成分-靶点-通路”的关联性提示其治疗肺纤维化的机制是一个复杂的的生物过程。所以,本研究具有重要的意义和应用前景,后续将按创新药物的要求进一步细化研究方案,以期将该有效组方开发成国家六类新药。