论文部分内容阅读
目的:烟曲霉是一种条件致病菌,人体依靠肺巨噬细胞清除吸入的烟曲霉孢子。烟曲霉是最普遍的可引起侵袭性曲霉病的病原体,由于许多抗真菌药物毒性大、效率低和不断增长的抗药性使可使用的抗真菌疗法变得非常有限。激活烟曲霉内生的凋亡成为对抗侵袭性曲霉病和其他真菌引发疾病的新希望。更多了解凋亡相关基因可以为发展新的抗真菌药物提供理论依据。蛋白激酶A对于多种真菌的生长、形态及毒性等都有着至关重要的调节作用。人体依靠氧化压力清除体内萌发的烟曲霉孢子,而蛋白激酶A是多种真核生物的压力应答调节器,pkaR为蛋白激酶A的调节亚基,因此,研究pkaR基因在氧化压力下对烟曲霉萌发孢子凋亡的影响及其调节机制,具有重要的生物医学意义。方法:比较野生株和pkaR基因缺失突变株的萌发孢子在氧化压力条件下的凋亡参数,来研究pkaR基因是否参与烟曲霉在氧化压力下凋亡的调控。培养野生株和pkaR基因缺失突变株的萌发孢子,选择双氧水作为氧化压力与萌发孢子孵育。萌发孢子经过氧化压力刺激后,通过亚甲基蓝染色和再生实验检测经氧化压力刺激后萌发孢子活性;DCFH-DA染色检测在相同氧化压力条件下野生株和突变株萌发孢子内的ROS产生情况;TUNEL实验检测萌发孢子的DNA断裂情况,作为判断萌发孢子凋亡情况的依据;PI染色检测经氧化压力作用后萌发孢子细胞膜的完整性。结果:亚甲基蓝实验结果显示,经氧化压力处理pkaR基因缺失突变株萌发孢子的存活率明显高于野生株;胞内ROS含量检测结果显示,较低强度的氧化压力条件下WT株萌发孢子的ROS产生被促进,较高强度的氧化压力条件下ROS产生被抑制,与野生株相反突变株在较低氧化压力条件下ROS产量低,较高氧化压力条件下ROS产量高,在氧化压力条件下野生株和突变株萌发孢子的ROS含量有显著差异;TUNEL实验表明,随着氧化压力的提高,野生株凋亡的萌发孢子数量经历升高再降低的过程,而突变株凋亡的萌发孢子数量无显著变化,野生株与突变株相比凋亡的萌发孢子数量有显著差异;PI实验表明,在氧化压力条件下WT株的萌发孢子细胞膜受到的损伤更大,即坏死细胞更多,与突变株相比对于氧化损伤的抵抗能力更弱。结论:亚甲基蓝染色作为一种检测菌体存活率的方法,可以应用于烟曲霉萌发孢子活性的检测中;pkaR基因敲除后突变株的萌发孢子存活率更高,对于氧化压力的敏感性降低,说明pkaR基因影响烟曲霉萌发孢子对于氧化损伤的抵抗;经氧化压力刺激后,野生株与突变株的ROS产量有显著差异,说明pkaR基因参与调节烟曲霉萌发孢子ROS产生;在相同氧化压力条件下,野生株与突变株凋亡的萌发孢子数量有显著差异,说明pkaR基因参与调控烟曲霉萌发孢子的凋亡。