论文部分内容阅读
[目的]本研究旨在探讨A20的O-GlcNAc(氧连-N-乙酰葡萄糖胺)修饰对NF-KB信号通路的调节效应,阐明细胞内蛋白质O-GlcNAc修饰对A20活性的影响及其在抗炎效应中的作用,从而明确蛋白质O-GlcNAc修饰提供血管保护效应的关键靶点。[方法](1)分别给予大鼠主动脉平滑肌细胞(rat aortic smooth muscle cells, RASMCs)转染空载体腺病毒(AD-NULL)、携带A20消减基因的腺病毒(AD-shA20-2)以及携带A20过表达基因的腺病毒(AD-A20-IRES)后,再给予Thiamet-G (150nmol/ml)页处理1小时,接着给予TNF-a (lOng/ml)处理6小时,提取RNA样本,采用real-time RT-PCR检测炎症因子MCP-1、P-selectin的mRNA表达。(2)分别给予RASMCs转染AD-NULL、AD-shA20-2及AD-A20-IRES后,给予Thiamet-G预处理(150nmol/ml) 1小时,随后将细胞接种在Boyden小室上腔,下腔注入含有TNF-α (10ng/ml)的DMEM,继续孵育24小时,细胞经固定、染色、漂洗,随机选择10个视野计数迁移至小室底面的细胞数量。(3)分别给予RASMCs转染AD-NULL、AD-shA20-2及AD-A20-IRES,接种至96孔板,饥饿细胞,给予Thiamet-G (150nmol/ml)预处理1小时,再给予10%FBS孵育24小时,采用CCK8试剂盒检测细胞的增殖情况。[结果](1)在转染AD-NULL的RASMCs, Thiamet-G预处理快速提高细胞O-GlcNAc修饰水平能够显著抑制TNF-a诱导的炎症因子MCP-1、P-selectin表达；在转染AD-shA20-2的RASMCs, A20蛋白表达明显减少,而Thiamet-G预处理不再能够抑制TNF-α诱导的炎症因子表达；转染AD-A20-IRES可显著增加A20蛋白表达,Thiamet-G预处理仍然能够抑制TNF-α诱导的炎症因子表达。(2)在转染AD-NULL的RASMCs, Thiamet-G预处理快速提高细胞O-GlcNAc修饰水平能够显著抑制TNF-α诱导的RASMCs迁移；在转染AD-shA20-2的RASMCs, Thiamet-G预处理不再能够抑制TNF-a诱导的RASMCs迁移；而在转染AD-A20-IRES的RASMCs, Thiamet-G预处理仍然能够抑制TNF-α诱导的RASMCs迁移。(3)在转染AD-NULL的RASMCs, Thiamet-G预处理快速提高细胞O-GlcNAc修饰水平能够显著抑制血清诱导的RASMCs增殖；在转染AD-shA20-2的RASMCs,消减A20蛋白表达可废除Thiamet-G对血清诱导RASMCs增殖的抑制；相反,过表达A20蛋白并不影响Thiamet-G对血清诱导RASMCs增殖的抑制。[结论]快速提高细胞内I-GlcNAc修饰水平能够显著抑制TNF-a诱导的RASMCs炎症介质表达和迁移以及血清诱导的RASMCs增殖,腺病毒介导的A20消减可以废除快速O-GlcNAc修饰对TNF-α诱导的RASMCs炎症介质表达和迁移的抑制以及对血清诱导RASMCs增殖的抑制。因此,A20很有可能是介导快速O-GlcNAc修饰对血管保护效应的关键分子靶标。