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本文以药用植物半夏叶片为材料,通过比较直接和间接器官发生两种途径,建立了半夏一步成苗的快速繁殖技术体系,并对组培形成的小块茎进行了药用成分分析,以期为工厂化生产种苗和生产有用的药效成分提供资料;通过细胞悬浮培养,初步建立了半夏的体细胞胚胎发生体系,对揭示细胞分化、发育、形态发生、合子胚发育等理论问题具有重要意义。主要实验结果如下:
1.半夏离体叶片高频率再生体系的建立MS培养基中添加2,4-D与KT两种激素可在同一种培养基上实现植株再生,培养期间经过愈伤组织阶段,90天左右方可得到再生植株。一步成苗培养基为MS+0.5mg/L2,4-D+1.0mg/LKT,愈伤组织诱导率高达78%,植株分化率为92%,每个外植体上分化的块茎数为9.13±3.55。附加NAA与BA两种激素对一步成苗培养基进行优化,筛选出一步成苗最佳培养基MS+0.5mg/LNAA+0.1mg/LBA,叶片在培养过程中没有明显的愈伤组织形成,60天后就可直接发育成完整植株。植株分化率为76%,每个外植体上分化的块茎数高达9.97±0.81。对这种培养基上的再生小植株进行移栽,一个月后,移栽成活率达100%。
2.组培与栽培半夏药用成分分析以盐酸麻黄碱为标准品,将组培小块茎和栽培半夏块茎粉末分别用有机溶剂氯仿回流提取,经紫外-可见分光光度计测定分析表明,组培小块茎中的总生物碱含量略高于栽培半夏块茎,前者为0.165%,后者为0.140%。另以β-谷甾醇为标准品,将组培小块茎和栽培半夏块茎粉末用无水石油醚冷浸提取,经薄层层析分析,比较其图谱表明,组培小块茎与栽培半夏块茎中都含有β-谷甾醇成分。
3.胚性愈伤组织的获得半夏叶片在附加3.0mg/L2,4-D和0.5mg/LBA的MS培养基上可诱导形成疏松愈伤组织,诱导率为77%。愈伤组织转移至相同培养基上,经5次继代后能够转变成胚性愈伤组织。胚性愈伤组织生长旺盛,呈淡黄色、颗粒状,结构松散,适于作细胞悬浮培养的材料。半夏胚性愈伤组织的生长周期约42天,生长曲线基本呈S型,包括延迟期、对数生长期、平稳期和静止期等几个时期,生物量在39天时达到最大值,为10.75g/LDW。
4.悬浮培养下体细胞胚胎发生用附加3.0mg/L2,4-D,0.5mg/LBA和300mg/LLH的MS液体培养基对胚性愈伤组织进行悬浮震荡培养,经8~9次继代后得到分散性好的细胞悬浮系,其细胞多为圆形或椭圆形,具有较强的分裂能力。所得的悬浮系接种于含1.0mg/L2,4-D,0.2mg/LBA和300mg/LH的MS液体培养基中震荡培养,可产生大量的球形胚,这些体细胞胚转入附加0.1mg/LNAA,0.2mg/LBA和300mg/LLH的MS液体分化培养基中,可进一步发育成心形胚、鱼雷形胚和子叶形胚。另外,还观察到次生胚。成熟胚转移到MS固体分化培养基上,可发育为正常小植株。