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选题依据:衰老是必然的。随着衰老的发生,机体对抗外界压力的能力减弱并加剧与衰老相关疾病的发生率。而且,随着经济和生活水平的日益提高,保健养生防衰老成为当下人们迫切的需求。因此从中药中筛选抗衰老有效成分成为当前的研究热点。中药黄芩为唇形科植物黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的干燥根,黄酮类成分为其主要的活性成分,包括黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷和汉黄芩素等,它们的药理作用广泛,主要包括:抗氧化、抗炎、神经保护、抗病毒以及抗肿瘤作用等。文献报道黄芩粗提物,如醇提物、水提物、茎叶黄酮和多糖等均具有抗衰老活性,而且目前对于黄芩中抗衰老有效成分的研究主要集中在含量最高的黄芩苷和黄芩素上,但对于黄芩中其他黄酮类化合物的抗衰老研究尚未见报道。因此,本课题旨在筛选出的黄芩中抗衰老活性部位的基础上,对各部位中未见报道抗衰老作用的主要黄酮类成分进行抗衰老活性评价和作用机制研究。目的:1.确定有效部位制备工艺并验证其抗衰老活性;2.明确各部位中主要黄酮类成分的抗衰老活性及其作用机制。方法:1.采用大孔吸附树脂对黄芩醇提物进行分离,得到水、50%乙醇和95%乙醇三个分离部位;采用高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)对各部位进行主要化学成分分析;以果蝇为模型,将得到的三个部位分别以两个不同浓度(0.15 mg/mL和3 mg/mL)饲喂果蝇,并以空白为对照,考察不同部位对自然衰老果蝇寿命的影响,以筛选出有效部位。2.采用HPLC对抗衰老活性部位—50%乙醇分离部位进行成分分析,对该部位中未报道抗衰老活性的主要成分汉黄芩苷进行抗衰老活性评价及其作用机制研究。以不同浓度的汉黄芩苷(0.02 mg/mL和0.5 mg/mL)饲喂果蝇,并以空白为对照,考察其对自然衰老果蝇寿命的影响;通过检测超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)的活性以及铜锌超氧化物歧化酶(copper-zinc superoxide dismutase,SOD1)基因、锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,SOD2)基因、CAT基因和玛士撒拉(methuselah,MTH)基因的表达水平评价汉黄芩苷的体内抗氧化能力;通过超高效液相色谱串联质谱(ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry,UPLCMS/MS)代谢组学技术探讨汉黄芩苷延缓果蝇衰老的作用机制。3.采用HPLC对95%乙醇分离部位进行成分分析,对该部位中未报道抗衰老活性的主要成分汉黄芩素进行抗衰老活性评价及其作用机制研究。以不同浓度的汉黄芩素(0.02 mg/mL和0.5 mg/mL)饲喂果蝇,并以空白为对照,考察其对自然衰老果蝇寿命的影响;通过检测抗氧化酶SOD和CAT的含量以及抗氧化基因SOD1、SOD2、CAT和长寿基因MTH的表达水平评价汉黄芩素的体内抗氧化活性;通过UPLC-MS/MS代谢组学技术研究汉黄芩素干预衰老的作用机制。结果:1.HPLC结果显示黄芩水分离部位的紫外吸收较弱,应主要为多糖类成分,50%乙醇分离部位主要成分是黄芩苷和汉黄芩苷,95%乙醇分离部位主要成分是黄芩素和汉黄芩素。果蝇寿命结果显示,黄芩水和50%乙醇分离部位均能够显著延长自然衰老果蝇的平均寿命(P<0.001),且50%乙醇分离部位能显著延长果蝇的最高寿命(P<0.05或P<0.01)。2.汉黄芩苷能够显著延长果蝇的平均寿命(P<0.01)和最高寿命(P<0.05或P<0.001)。生化指标检测结果显示,汉黄芩苷能够显著提高果蝇体内抗氧化酶SOD和CAT的含量(P<0.05或P<0.01);RT-PCR结果显示,汉黄芩苷显著上调果蝇体内抗氧化酶相关基因SOD1、SOD2和CAT的表达水平(P<0.01或P<0.001)并下调MTH的表达水平(P<0.001);对不同组果蝇的代谢轮廓进行分析,共找到27个与衰老相关的差异代谢物,汉黄芩苷回调的有17个:L-精氨酸、焦谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-乙酰肉碱、UDP-N-乙酰葡糖胺、L-异亮氨酸、3-羟基癸酸、溶血磷脂酰乙醇胺(Lysophosphatidylethanolamine,LysoPE)(18:3)、溶血磷脂酰胆碱(Lysophosphatidylcholine,LysoPC)(18:3)、LysoPE(16:1)、LysoPC(16:1)、LysoPC(16:0)、亚油酰肉碱、LysoPE(18:1)、LysoPC(18:1)、L-棕榈酰肉碱和反油酸肉碱。这17个潜在生物标志物主要参与氨基酸代谢(D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,精氨酸和脯氨酸代谢,缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸合成)和能量代谢(氮代谢)。3.果蝇寿命结果显示汉黄芩素能够延长果蝇的平均寿命(P<0.05或P<0.001)和最高寿命(P<0.01)。生化指标检测结果显示,汉黄芩素能够显著提高果蝇体内SOD和CAT的活性(P<0.05);RT-PCR结果显示,汉黄芩素显著上调果蝇体内SOD1和SOD2基因的表达水平(P<0.05),下调MTH基因表达水平(P<0.05或P<0.01);代谢组学结果显示,汉黄芩素能够调节果蝇体内与衰老相关的16个差异代谢物:L-精氨酸、焦谷氨酸、胆碱、L-谷氨酰胺、UDP-N-乙酰葡糖胺、L-异亮氨酸、3-羟基癸酸、LysoPE(18:3)、LysoPE(16:1)、LysoPC(16:1)、LysoPC(16:0)、亚油酰肉碱、LysoPE(18:1)、LysoPC(18:1)、L-棕榈酰肉碱和反油酸肉碱。这16个差异代谢物主要参与氨基酸代谢(D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,精氨酸和脯氨酸代谢,缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸合成),能量代谢(氮代谢)和脂质代谢(甘油磷脂代谢)。结论:黄芩水和50%乙醇分离部位能够延长果蝇寿命;汉黄芩苷和汉黄芩素均能延缓果蝇衰老,其作用机制与增加抗氧化酶活性,上调抗氧化基因表达和调控不同代谢途径进而改善机体氧化应激和代谢紊乱密切相关。