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鱼粉是鱼类饲料中一种重要的蛋白源。然而,近几十年来,由于养殖产业对鱼粉的需求量不断增加促使研究者找寻一种低价、来源广泛且可持续发展的蛋白源来替代鱼粉。目前,已证实酶解产物中含有不同分子量的生物活性肽,这些肽具有抗氧化、增强免疫、促生长和抗肿瘤性等多种功能。然而,当前诸多研究主要集中在生长、体组成和生化指标等方面,有关机制的研究尚不多见。因此,本试验以团头鲂和建鲤为研究对象,从表观评价酶解产物对鱼的影响,在此基础上,利用基因和蛋白技术探究酶解产物对鱼生长和健康的影响机制,然后,从棉粕蛋白酶解产物中筛选出具有抗氧化和免疫增强功能的活性肽,并进行验证。本试验包括7大部分:1棉粕酶解产物替代鱼粉对团头鲂生长和肠道功能的影响本试验旨在分析和探讨棉粕酶解产物（CPH）替代鱼粉对团头鲂生长和肠道功能的影响,分别添加 0%（CPH 0）、1%（CPH1）、3%（CPH 3）、5%（CPH 5）和 7%CPH（CPH 7）代替鱼粉,配制了 5种等氮（320 g/kg粗蛋白）和等能（17.8 MJ/kg总能）饲料。结果显示:CPH5和CPH7组试验鱼生长性能显著降低（P＜0.05）。各组间饵料系数（FCR）、肥满度（CFI）、胴体比（HIS）和脏体比（VSI）无显著差异（P＞0.05）。蛋白酶和淀粉酶、Na+,K+-ATP酶、酸性磷酸酶（CK）和γ-谷氨酰胺转移酶（γ-GT）活性随着日粮中CPH添加量的增加而升高,最大值出现在CPH3添加组,然而随着添加量的继续增加而呈现下降趋势。CPH3组试验鱼前、中肠段微绒毛长度显著高于其他各组（P＜0.05）。在基因水平,CPH1和CPH3组试验鱼体内GH,GHR和IGF-ImRNA表达水平显著高于对照组（P＜0.05）。日粮中添加5%和7%CPH显著上调TNF-α、IL-6和IKK-α mRNA表达水平（P＜0.05）,同时降低IκB-α mRNA水平（P＜0.05）。因此,适宜的棉粕酶解产物替代鱼粉不会影响团头鲂生长性能,这可能是因为棉粕酶解产物增强了团头鲂肠道对营养物质的消化和吸收功能。2棉粕酶解产物替代鱼粉对团头鲂氨基酸代谢的影响本试验旨在研究棉粕酶解产物（CPH）替代鱼粉如何通过能量感应和TOR信号通路影响氨基酸代谢。试验设计和试验鱼饲养管理同第一部分。结果表明:日粮中添加3%CPH对试验鱼血浆中天门冬氨酸转氨酶（GOT）、丙氨酸转氨酶（GPT）、琥珀酸脱氢酶（SDH）、黄嘌呤氧化酶（XOD）含量及肝脏中SDH、XOD含量未产生显著影响（P＞0.05）,但显著升高肝脏中GOT和GPT含量（P＜0.05）。与对照组相比,CPH 5和CPH7组试验鱼血浆中苏氨酸（Thr）、缬氨酸（Val）、赖氨酸（Lys）、组氨酸（His）、总必需氨基酸、总氨基酸含量和热单位生长系数（TGC）显著降低（P＜0.05）。CPH7组试验鱼肌肉中苏氨酸（Thr）、缬氨酸（Val）、异亮氨酸（Ile）和亮氨酸（Leu）呈现出同样趋势。5%和7%CPH显著降低肝脏和肠道中TOR和S6K1 mRNA表达水平,但上调4E-BP2 mRNA表达水平（P＜0.05）,同时增加了肝脏中AMPK-α1、AMPK-α2和Sirt-1 mRNA表达水平以及t-AMPKα蛋白质含量。因此,日粮中添加5%和7%可以激活AMPK/SIRT1,抑制TOR信号通路,降低蛋白质合成,维持鱼体内氨基酸的动态平衡。3棉粕酶解产物替代鱼粉对团头鲂抗氧化能力和免疫力的影响本试验为了探究棉粕酶解产物（CPH）替代鱼粉对团头鲂抗氧化能力和免疫力的影响。试验设计和试验鱼饲养管理同第一部分。生长试验结束后,进行攻毒试验。预实验中,先用肉汤将活化后嗜水气单胞菌稀释成五个不同梯度浓度:1×105 CFU/mL、1 ×106 CFU/mL、1×107 CFU/mL、1×108 CFU/mL 和 1×109 CFU/mL。再将各浓度菌液分别注射给10尾试验用鱼,最后计算出96h半致死浓度（LC50）为1 ×108 CFU/mL。最终将胁迫试验所用的嗜水气单胞菌浓度设定为1×108 CFU/mL。待养殖试验结束后,用医用注射器将预先配好的菌液注射到鱼的腹腔,每组注射20尾试验鱼,每尾注射量为1mL/100g。注射后,统计第6h、12h、24h、36h、48 h、72h和96h试验鱼死亡数。结果显示:CPH1和CPH3组试验鱼肝脏中超氧化物歧化酶（t-SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性显著高于对照组（P＜0.05）。然而,CPH5和CPH7组试验鱼肝脏内丙二醛（MDA）含量显著高于对照组（P＜0.05）。试验鱼血清中总蛋白、白蛋白、球蛋白、溶菌酶和酸性磷酸酶（ACP）含量随着日粮中CPH添加量的增加而升高,最大值出现在CPH3组,然而随着添加量的继续增加而呈现下降趋势。其次,CPH3组试验鱼血浆中C3和C4水平显著高于对照组（P＜0.05）。CPH1和CPH3组试验鱼肝脏和脾脏中免疫相关基因（Leap-1和Leap-2）表达水平显著高于对照组（P＜0.05）。攻毒后,CPH3组试验鱼在各时间段的累计死亡率低于对照组。因此,日粮中添加1%和3%棉粕酶解产物不仅可以提高团头鲂抗氧化能力,而且还能增强团头鲂非特异性免疫力和细菌抵抗力。4酵母酶解产物替代鱼粉对建鲤生长和肠道形态的影响本试验旨在研究酵母酶解产物（YH）替代鱼粉对建鲤生长和肠道形态的影响,设计了 5种等氮（340 g/kg粗蛋白）和等能（17.5 MJ/kg总能）饲料,分别添加0%（YH 0）、1%（YH 1）、3%（YH 3）、5%（YH 5）和 7%（YH 7）YH 代替鱼粉。结果显示:日粮中 YH的不同添加水平对试验鱼增重率产生显著影响（P＜0.05）,其中最大值出现在YH3组。此外,YH3组试验鱼肠道微绒毛长度显著高于对照组（P＜0.05）。在基因水平,YH7组试验鱼前肠和中肠段炎症相关基因（ALP,IL-1β和TNF-α）表达水平显著高于对照组（P＜0.05）。在前肠段,YH3组和YH5组试验鱼炎症相关基因的表达水平低于对照组,但差异不显著（P＞0.05）。然而,在中肠段,YH3组和YH5组试验鱼ALP,IL-1β和TNF-α表达水平显著低于对照组（P＜0.05）。因此,添加3%酵母酶解产物可以提高建鲤生长性能,维持肠道健康。5酵母酶解产物替代鱼粉对建鲤抗氧化和免疫系统的影响本试验为了分析和探讨酵母酶解产物（YH）替代鱼粉对建鲤抗氧化能力和免疫系统的影响。试验设计和试验鱼饲养管理同第四部分。生长试验结束后,用医用注射器将浓度为1×107 CFU/mL的菌液注射到鱼的腹腔,每组注射20尾试验鱼,每尾注射量为1mL/100g。48h后采样。结果表明:YH1和YH3组试验鱼肝脏中超氧化物歧化酶（t-SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）和谷胱甘肽（GSH）活性明显高于对照组（P＜0.05）。胁迫前,YH3组试验鱼血浆中溶菌酶、总蛋白、白蛋白、补体C3和补体C4含量显著高于对照组（P＜0.05）。胁迫后,各试验组建鲤血浆中溶菌酶、总蛋白、白蛋白、补体C3和补体C4含量显著高于对照组（P＜0.05）。在基因水平,胁迫前,YH1和YH7组试验鱼肝脏和脾脏中炎性相关基因（ALP,IL-1β和TNF-α）表达水平显著高于对照组（P＜0.05）。在肝脏和脾脏中,除了 MBL-2和MASP外,其它补体相关基因表达水平均呈现出先升高后下降趋势,其中最高值出现在YH3组。此外,在YH1、YH5和YH7组MBL-2和MASP表达水平显著低于对照组（P＜0.05）。因此,日粮中添加1%和3%酵母酶解产物不仅能提高建鲤抗氧化能力,而且还能通过激活经典补体激活途径和旁路补体激活途径,提高了建鲤对嗜水气单胞菌抵抗力。6酵母酶解产物和棉粕酶解产物对团头鲂肝细胞抗氧化能力和免疫力的影响本试验为了探究酵母酶解产物（YH）和棉粕酶解产物（CPH）对团头鲂肝细胞抗氧化性和免疫力的影响。用高锰酸钾溶液将团头鲂消毒后,小心地取出肝脏并转移到无菌培养皿中。然后用5倍体积无菌PBS冲洗肝脏。尔后,用无菌胰蛋白酶在37℃下消化40 min,再用细胞筛（70μm）过滤消化液,将肝细胞收集在无菌离心管中,用离心机以1000 r/min速度离心5min。最后,用DMEM/F12培养基将肝细胞稀释至105 cell/mL。本试验将3mL浓度为3×105 cell/mL的肝细胞加入6孔培养板,设置二个试验组,一组为对照组（C）、另外一组为试验组（T）,每组设置4个重复。对照组中添加培养基,试验组添加酶解产物,培养24h后,采样并分析。结果显示:YH和CPH对培养基中GOT、GTP和LDH活性并未产生影响,然而,二者显著升高了肝细胞GOT和GTP活性（P＜0.05）。其次,YH和CPH升高了培养基中SOD和CAT活性,同时降低了培养基中MDA含量（P＜0.05）。通过基因分析发现YH显著上调了SOD和CAT表达水平,下调了NOX2,Keap1,Nrf2和Bach1表达水平（P＜0.05）。此外,YH和CPH显著上调了免疫相关（Leap1和Leap2）基因表达水平（P＜0.05）。因此,酵母酶解产物和棉粕酶解产物不仅能增强团头鲂肝细胞免疫力,而且还能通过抑制Nrf2-Keap1通路基因来提高肝细胞抗氧化能力。此外,酵母酶解产物和棉粕酶解产物还能提高团头鲂肝细胞代谢水平。7棉粕酶解产物中抗氧化和免疫增强作用的活性肽的筛选在第六部分研究基础上,结合棉粕酶解产物中肽序列的分析结果,本课题组从棉粕酶解产物中选取六种具有特定结构的肽（P1～P6）作为研究对象,通过团头鲂肝细胞培养试验,旨在从棉粕蛋白酶解物中筛选具有抗氧化和免疫增强作用的活性肽。本试验将3mL浓度为1×105 cell/mL的肝细胞加入6孔培养板,设置三个试验组:对照组（C）、试验组（P1～P6）和氨基酸组（A）:对照组添加培养基,试验组添加肽,氨基酸组添加氨基酸,每组设置4个重复。培养24h后采样、分析。结果表明:P1和P2显著降低培养基中GOT和GPT活性（P＜0.05）,P4对培养基中GOT和GPT活性没有产生显著影响,但显著升高SOD和CAT活性（P＜0.05）。其次,P2和P6的添加对肝细胞GOT活性无显著影响（P＞0.05）,但降低了 GTP活性（P＜0.05）。此外,P4上调肝细胞SOD、CAT、Leap1和Leap2 mRNA表达水平（P＜0.05）,同时下调Nox2和Nrf2表达水平（P＜0.05）。因此,P4具有抗氧化和增强免疫功能,其氨基酸序列为LGSPVIVIR（亮-甘-丝-脯-天冬-缬-异亮-缬-异亮-精）。