转基因海岛棉新海33畸形苗核型分析的研究

• 作 者: 古丽娜耳·艾拜都拉
• 出 处: 新疆农业大学
• 发表日期: 2004年期
• 关键词: 转基因海岛棉 畸形苗 核型分析 流式细胞仪 SSR分子标记

畸形苗的发生是植物组织培养中一种常见的生理异常现象,严重制约着植物组织培养技术的发展。在海岛棉体细胞胚体系中,长时间的细胞培养常会引起染色体发生畸变,从而影响后续正常植株尤其是转基因植株的获得。畸形苗是否为基因突变或染色体畸变的结果是决定了我们后续研究方向的关键问题之一。为更好地检测染色体是否发生畸变,本研究以海岛棉“新海33”为材料,分别从选材材料、预处理条件、水解条件、染色时间等方面对海岛棉染色体的核型分析体系进行了优化。并在此基础上对海岛棉野生型和转基因畸形苗细胞进行核型分析,利用流式细胞仪技术对野生型和转基因型海岛棉植株既新鲜又幼嫩的叶片细胞进行了检测,同时通过SSR分子标记鉴定体细胞胚发生体系获得海岛棉植株的遗传特性。主要研究结果如下:1.分别对根尖、胚性愈伤组织、幼嫩叶片在同种方法下的制片效果都不同。根尖的分生组织是有丝分裂最旺盛,细胞壁最薄,因此中期分裂相最多、最清晰、制片效果最好,是观察染色体与计数的最佳材料。胚性细胞的体积比体细胞的小,因此无法在油镜条件下观察到清晰的图像,幼嫩的叶片由于细胞连接比跟进细胞的更紧密,无法同等水解条件处理下获得单细胞,观察细胞核的染色体状态。因此,根尖细胞是后续核型分析的优化材料。2.分别选取0.02%的秋水仙素溶液、饱和对二氯苯溶液、0.002 mol/L八羟基喹啉溶液,在4℃下,进行预处理,所需时间都是4 h。其中,0.02%的秋水仙素溶液是最好的预处理剂,处理后的染色体形态最佳,有利于进一步的分析。因此,本研究选取0.02%的秋水仙素是后续核型分析的最佳预处理剂。3.分别用预热60℃的1 mol/L盐酸处理10min、用浓盐酸处理15s、蜗牛酶、混合酶(1%的果胶酶+1%纤维素酶)都室温处理3h。预热60℃的1 mol/L盐酸水解效率最高,解离后的组织呈稀泥状,容易获得单细胞,可以观察到中期染色体。因此,我们选取预热60℃的1 mol/L盐酸作为后续核型分析的水解条件。4.分别用苯酚品红溶液染色1min、5min、10min、15min。染色时间为10 min时,细胞质着色浅甚至不着色,细胞核与染色体着色深,就能看清楚染色体的中期分裂相。因此,我们选取10 min作为后续核型分析的染色条件。5.对海岛棉染色体的核型分析体系进行优化的基础上,分别对海岛棉野生型和转基因畸形苗细胞进行核型分析。野生型与转基因型海岛棉新海33染色体均为四倍体,基数为13,核型均属于4B型;不管是野生型染色体还是转基因型染色体,都以中性染色体,中间着丝粒染色体为主,都没有端部着丝粒染色体。核型公式分别为2n=4x=52=20m+20sm+12st与2n=4x=52=32m+16sm+4st(1 SAT),构成成分分别为4L+8M+1S与3L+8M+2S,都属于进化类型。6.为了进一步检测野生型和转基因型海岛棉细胞的基因组DNA是否发生改变,我们利用流式细胞仪技术分别对野生型和转基因型海岛棉植株既新鲜又幼嫩的叶片细胞进行了分析。野生型海岛棉细胞中DNA含量大多集中在100数量级,而转基因海岛棉细胞中的DNA含量大多集中于120数量级,略大于100,两者细胞的DNA含量的确存在差异。流式细胞仪检测结果进一步证实了转基因畸形苗与野生型基因组倍性上存在不同。7.为了验证畸形苗的基因组序列信息上是否有序列上的改变,采用提取野生型和体细胞胚发生体系获得的海岛棉植株的基因组DNA,进行SSR分析。我们将提取的DNA进行稀释至10-100ng/μL,用于后续PCR扩增,为了便于后续的试验顺利的进行。每个SSR引物进行3次样品PCR重复,其结果一致,表明实验结果可信。与野生型相比,体细胞胚发生体系获得的新海33的DNA的条带的数目和分子量大小也存在一定差异,表明体细胞胚发生体系获得的新海33的基因型发生了变化。SSR分子标记鉴定结果表明,再生海岛棉新海33与野生型植株相比在序列组成上发生了改变。本研究结果阐明畸形苗的分子机制部分,有助于体细胞胚体系正常植株的筛选和培育。