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本研究以蛋白质含量丰富的紫菜为原材料,使用溶胀法和组织捣碎法相结合的方法处理紫菜,再用硫酸铵盐析制得藻胆蛋白粗提液,最后采用连续二次不同柱长规格的羟基磷灰石柱层析法进行纯化,快速高效的分离纯化紫菜藻胆蛋白,获得纯度和得率均较高的藻红蛋白,并对该蛋白的光谱学性质,亚基组成,稳定性,以及其在体外清除自由基和体内抗氧化能力方面的活性进行研究。
本实验将冻干紫菜粉碎后用40倍体积的水溶涨6天后经组织捣碎2分钟,再用饱和度为45%的硫酸铵盐析沉淀,经透析脱盐后即得藻胆蛋白粗提物(CPP)。CPP经过连续二次不同柱长规格的羟基磷灰石柱层析,离子浓度梯度沈脱,从而分离得到较高纯度的藻红蛋白。最终纯化的紫菜藻红蛋白的纯度系数(A565nm/A280nm)为4.0。根据其可见光光谱学特征判断紫菜藻红蛋白属于R-藻红蛋白(R-PE),R-PE的吸收峰在565nm和498nm,在540nm处有一个吸收肩。用SDS-PAGE测定组成藻红蛋白各亚基的分子量,α亚基的相对分子质量约为19kDa~21kDa,β亚基的相对分子质量约为20kDa~22kDa,γ亚基的分子质量约为36kDa。推测坛紫菜R-PE的分子量约为290kDa。
稳定性试验结果表明:藻胆蛋白在pH值为中性及偏酸性时,具有较好的稳定性,pH为强酸性或强碱性时,蛋白质不稳定。藻胆蛋白在温度低于40℃时,具有较好的稳定性,酒精浓度不超过40%时对其稳定性影响较小。若要长时间保存紫菜藻红蛋白,需将蛋白放在低温(4℃左右)的中性缓冲溶液中,且要求避光。
本实验采用邻二氮菲-Fe2+氧化法和邻苯三酚自氧化法分别测定藻胆蛋白粗体物和纯化后的藻红蛋白清除·OH和O-2·能力。并灌胃给予小鼠100、200、300(mg·kg-1·d-1)的CPP,连续灌胃25天后,分别测定小鼠全血过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽氧化物酶(GSH-Px)活性,以及红细胞丙二醛(MDA)含量和血清总SOD活性。体外清除自由基的实验结果显示:紫菜藻胆蛋白粗提物对羟自由基的半数清除率(IC50)为92μg/ml,对超氧阴离子自由基的IC50为101μg/ml;纯化后的藻红蛋白对羟自由基的半数清除率(IC50)为97μg/ml,对超氧阴离子自由基的IC50为142μg/ml。动物实验的结果显示紫菜藻胆蛋白能在一定剂量范围内提高小鼠血液中CAT、GSH-Px和SOD活性,并降低MDA的含量,以中等剂量时效果最为显著并且浓度过高时其作用有所下降。说明CPP在适当剂量下具有明显的抗氧化能力,但无量效关系。由此可见,藻胆蛋白能够以多种途径发挥抗氧化作用,以减少组织细胞损伤,延缓机体的衰老。