百脉根碳酸酐酶基因在共生固氮中的功能研究

• 作 者: 张宝丽
• 出 处: 华中农业大学
• 发表日期: 2004年期
• 关键词: 碳酸酐酶 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 百脉根 共生固氮 CRISPR/Cas9

碳酸酐酶（Carbonic anhydrases,CA;EC 4.2.1.1）在自然界中的存在十分广泛,在微生物、动物和植物中都陆续鉴定到了CA的存在。CA是一种金属酶,在生物体中催化CO₂和HCO₃^-之间的可逆反应:CO₂+H₂O?HCO₃^-+H⁺,该反应对于生物体的正常生长代谢具有十分重要的作用,CA的存在大大加速了这一反应的进行。目前已经发现自然界中存在6类CA基因,分别为:α-、β-、γ-、δ-、ε-和ζ-CA,植物中主要存在的CA类型为α-、β-和γ-CAs,并且大多数植物中的CA是以多基因家族存在的,不同CA在同一生物体内的存在部位和表达量也因各自的功能而不一样。截止目前,在植物中发现的CA在光合反应、生物胁迫、种子发育、p H调节、生物合成等方面都发挥着一定的作用。在豆科植物苜蓿、大豆和百脉根中也都陆续鉴定到了CA的存在,但是关于CA在豆科作物和根瘤菌的共生固氮中的作用一直都不清楚,本研究以模式豆科作物百脉根为研究对象,分析百脉根中的CAs的家族进化、表达模式和突变体表型,目前为止取得的实验结果主要有以下几点:1. 以拟南芥的CAs为模板,在百脉根数据库网站中进行BLAST序列比对,找到百脉根中所有的CAs,和拟南芥中的CAs一起构建进化树。发现CAs在百脉根中属于多基因家族,有3类12个CAs基因:α-、β-和γ-CAs,其中,6个编码α-CAs,4个编码β-CAs,2个编码γ-CAs。在进化上,α-CAs和β-CAs的亲缘关系较近。2. 百脉根中的这些CAs具有不同的表达模式,Lj CAA1只在根瘤中表达。Lj CAA2除了在根中不表达,在其它组织中都有表达,且在幼苗中的表达量最高。Lj5g3v0670540.1在根、幼苗和根瘤中表达。Lj5g3v0670150.1在根、花、果荚和幼苗中表达,在根瘤中无表达。Lj3g3v3082370.1只在根中有微弱的表达。Lj CA1在百脉根所有组织中均有表达,且在根瘤中的表达最多。Lj6g3v2193530.1在除了根瘤的其他部位中极其微弱表达,在根瘤中无表达。Lj2g3v1002750.2只在地上部分表达,在叶片和子叶中表达最高。Lj2g3v1403790.1在所有组织中均有表达,在子叶中的表达最多。Lj CAA1在侵染细胞和非侵染细胞中均表达,Lj CAA2只在根瘤维管束中表达,Lj CA1在非侵染细胞中表达。3. 对百脉根中的单个CA基因进行敲除发现,并不会影响百脉根的共生固氮,ca1、caa1和caa3的纯合单突变体和caa1caa3的纯合双突变体均能够正常发挥固氮功能,且Lj CA1的纯合超表达植株也和野生型的表型没有明显差异。综上所述,本课题系统研究了百脉根中的碳酸酐酶基因,知道了碳酸酐酶基因在百脉根中的分类情况;碳酸酐酶在百脉根各组织中的表达情况;成功构建了纯合的ca1单突变体、caa1单突变体、caa3单突变体和caa1caa3的双突变体,并且对碳酸酐酶基因在百脉根中进行了功能预测,为以后继续深入研究碳酸酐酶基因打下了坚实的基础。