拟南芥ABC1类蛋白激酶AtABC1K14的功能及AtMMS21调控减数分裂的研究

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蛋白质翻译后修饰对精细调节蛋白质的功能至关重要,主要包括蛋磷酸化、乙酰化、甲基化、糖基化、泛素化和SUMO化等。本论文分别对参与磷酸化修饰的拟南芥类蛋白激酶AtABC1K14及参与SUMO化修饰的SUMOE3连接酶AtMMS21的功能展开研究,主要取得了以下结果:  第一部分:ABC1(for Activity ofbcl complex)类蛋白激酶是近年来在植物中发现的一类新的非典型性激酶。在酵母的研究中已发现ABC1蛋白激酶参与线粒体中醌的产生和电子转移。AtABC1K4基因由一个ABC1和一个β-内酰胺酶两个保守结构域构成。  RT-PCR检测AtABC1K4基因在拟南芥不同组织和器官中表达水平,结果表明该基因在拟南芥的根、茎、叶、花、角果等组织中均有表达,且叶片中表达最强,在根、角果中表达微弱。AtABC1K14-GFP瞬时转化拟南芥原生质体,用共聚焦激光显微镜观察发现AtABC1K14定位于细胞质。  在低光强(10μmol/m2·s)处理条件下突变下胚轴长度相对野生型变短,而在黑暗条件下突变体和野生型之间没有明显差异。在蓝光、红光以及远红光条件下,abc1k14突变体植株下胚轴长度显著低于野生型。  分别将ABC1和β-内酰胺酶结构域转化到abc1 k14突变体中均不能互补在弱光强下下胚轴伸长受抑制的表型,水稻中与AtABC1K14同源性较高的基因OsABC1K8的RNAi植株在弱光照条件下表现出株高降低。  Real-time结果显示在低光照条件下突变体中与避荫反应的相关基因表达发生变化。突变体中生长素合成相关的YUCCA2、YUCCA5、YUCCA9表达降低,TAA1表达升高;生长素运输载体PIN3表达没有变化;与赤霉素合成相关基因GA20OX1、GA20OX2表达升高。  在正常生长条件下abc1k14突变体与野生型之间没有明显差异,非生物胁迫处理发现在NaCl、MV、低温、重金属Cd2+等胁迫条件下突变体植株与野生型之间在种子萌发率上没有明显差异。在ABA处理条件下突变体子叶变绿率高于野生型。  将AtABC1K14蛋白的ABC1结构域,β-内酰胺酶结构域及AtABC1K14全长蛋白构建到原核表达载体中,诱导出相应的重组蛋白检测β-内酰胺酶的活性,发现各重组蛋白均没有β-内酰胺酶的活性,AtABC1K14蛋白的β-内酰胺酶活性可能在进化过程中丧失。  第二部分:SUMO E3连接酶AtMMS21是一个在真核生物中功能保守的蛋白,是染色体结构维持蛋白SMC复合体的一个组分,在人类和酵母中参与到DNA修复和基因组的稳定性维持。在拟南芥中缺失SUMO E3连接酶AtMMS21产生生长矮小及分生组织缺陷的表型。  在拟南芥AtMMS21缺失突变体中雄性配子体的减数分裂异常,减数分裂的产物中存在有大量的二分体和不规则四分体。在减数分裂第一次分裂的终变期mms21-1突变体的染色质浓缩与野生型相比较为松散,在减数分裂第一分裂后期出现染色体碎片和染色体桥,并且能观察到染色体不均等分离。在减数分裂的第二次分裂末期出现十条染色体分向两级形成二倍的配子体,有些染色体在第二次分裂末期不能均等的分离,形成不规则的四分体。突变体中的雌配子的发育也产生缺陷。  原位杂交结果显示AtMMS21在花药发育第六期表达最高。在mms21-1突变体花中,参与减数分裂过程相关的基因表达改变,参与减数分裂联会的基因ZYP1和ASY1表达下调。参与减数分裂重组的基因SPO11-1和RAD51表达上调。另外参与染色体结构维持的基因表达量也发生了变化。  在mms21-1突变体成熟花粉蛋白中SUMO化修饰结合蛋白也有明显不同,有一些SUMO化修饰蛋白条带在突变体中消失。通过共定位实验证实AtMMS21蛋白与染色体结构维持蛋白SMC5共定位于细胞质和细胞核中。表明AtMMS21可能介导靶蛋白的SUMOylation影响减数分裂进程中染色体的行为从而调控植物配子体的发育。
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