SNORD71在C2C12细胞系分化中的表达分析

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核仁小分子RNA是目前已知核内最丰富的小分子非编码RNA,主要参与核糖体RNA的修饰和剪切加工等,影响了核糖体的结构与功能。近年来研究发现,哺乳动物中snoRNA也能影响细胞的生长、疾病乃至癌症的发生,如U50对细胞的生存和增殖具有重要作用,是前列腺癌中一个潜在的肿瘤抑制因子。挖掘此类具有细胞学功能的snoRNA成为目前snoRNA研究中的一个新亮点。   脊椎动物中5.8S rRNA第14位的脲嘧啶(U14)的2-O-核糖甲基化修饰非常特殊,在正常组织与癌症细胞中存在明显的修饰程度差异;进一步研究还显示它可能是细胞分化的一个因子。那么指导该位点修饰的snoRNA SNORD71是否也与分化相关呢?通过Northern blot和RT-PCR等方法,我们发现SNORD71在来源于不同胚层、具备不同分生潜能的正常小鼠组织(腿肌、肝脏、胸腺和大脑)中的表达有差异。更重要的是,在小鼠成肌细胞系C2C12的不同分化阶段(分化诱导后0、4和8天),SNORD71的表达随分化的进行出现了明显的差异,说明SNORD71确实与细胞分化相关。这是首次发现组成性表达的snoRNA能在外界条件诱导下随细胞状态变化而变化。值得注意的是,SNORD71的表达在分化的第四天和第八天的差异不显著,暗示SNORD71可能是一个分化影响因子。随后我们对另两个snoRNA U96和U13也进行了表达分析,发现它们的表达在分化中也显著上调,趋势与SNORD71一致,暗示snoRNA在细胞分化中的差异表达不是个别案例,可能是一个集体性的事件。   内含子编码的snoRNA往往与其宿主基因在表达上存在协同性。SNORD71位于AP1G1基因中的内含子,为了验证SNORD71是否与宿主基因在表达上协同,我们用RT-PCR对AP1G1的转录本和成熟mRNA进行检测,发现在细胞分化过程中,AP1G1与SNORD71的变化趋势一致,说明SNORD71的表达变化可能由宿主基因的转录变化引起,即两者在表达上协同。AP1G1是细胞膜内吞小泡的组件,在细胞信号的传导中起着重要的作用,很有可能在细胞分化中有一定的作用。因此,结合SNORD71与其宿主基因表达上的协同性,它们可能还存在功能上的协同性。   越来越多的研究显示,snoRNA可以被加工成小分子起作用。为了弄清SNORD71是否会被加工成小分子片段来参与分化,我们采用Northern blot对文献预测的小分子片段进行实验验证,但并未检测到相应的小片段RNA。而目前所有的大规模克隆和测序均没有明显检测到来源于SNORD71的小片段RNA的稳定表达,暗示snoRNA被加工成小分子片段起作用的可能性较小。巧合的是,在成肌细胞分化前后,SNORD71的表达与文献报道的5.8S rRNA U14位点甲基化修饰在变化趋势和变化程度上均一致,由此我们推测SNORD71很可能是通过介导RNA修饰的途径来参与细胞的分化。   综上,本论文研究了SNORD71在小鼠C2C12细胞系的不同分化阶段中的表达,首次揭示了snoRNA与细胞分化相关,暗示了snoRNA的一个新细胞学功能。通过rRNA修饰的变化去寻找具有细胞学功能的snoRNA,是snoRNA功能研究的新思路。
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