论文部分内容阅读
乙型脑炎(Japanese encephalitis,JE)是由乙型脑炎病毒(JEV)引起的一种蚊媒性人兽共患传染病。该病主要引起母猪繁殖障碍、公猪单侧睾丸炎等症状,给养猪业带来巨大经济损失。因此对该病及时快速诊断,有利于降低经济损失。本研究运用免疫胶体金技术,对JEV快速检测试纸条的可行性做了初步的探索研究。本研究的主要内容如下：1.抗JEVE蛋白单克隆抗体的制备与纯化本研究以小鼠腹水诱导法大量制备单克隆抗体。利用复苏本实验室制备保存的JEV-1、JEV-3杂交瘤细胞,注射到提前用液体石蜡致敏的Ba1B/C小鼠,诱导小鼠产生含有单克隆抗体的腹水。腹水处理后通过辛酸-硫酸铵法和Protein A亲和层析法相结合获得纯化的单克隆抗体。经纯化、浓缩后的两种单抗浓度为分别为1.953mg/mL和2.637mg/mL,经SDS-PAGE电泳分析,IgG两条链条带清晰,经过纯化的单克隆抗体可以用来标记胶体金颗粒,制备免疫胶体金。2、免疫胶体金试纸条初步制备本研究采用柠檬酸钠换还原法制备胶体金溶液,肉眼观察胶体金溶液清澈透亮,呈酒红色,利用分光光度计在400nm-700nm波段进行扫描,扫描结果显示吸收峰的峰宽较窄,峰值较高,最大吸收波长为525nm。透射电镜下观察金颗粒大小一致,金颗粒直径25nm,符合试验要求。通过研究优化测得胶体金颗粒与单克隆抗体最适标记的pH值为8.5,1mL胶体金最低蛋白标记量为15μg,将待标记的抗体除盐处理后进行和金颗粒的标记,低温高速离心后得到纯化的免疫胶体金。将纯化的另一种抗乙型脑炎E蛋白的单克隆抗体抗包被在NC膜上作为T检测线,包被浓度0.8mg/mL,抗小鼠免疫球蛋白IgG二抗同样包被在NC膜上作为C质控线,包被浓度1mg/mL。NC膜包被后,使用封闭液PBS(含1%BSA,2.5%蔗糖,0.5%Tween-20)封闭处理30min干燥后备用。金标抗体使用稀释液PB(含2%BSA,2.5%蔗糖)按1：1的比例稀释喷在硼酸缓冲液(含1%BSA,0.02%NaN3)处理过的金标垫上,把样品垫、金标垫、NC膜、吸收垫按照一定次序贴在PVC支撑底板上,制备成免疫胶体金层析试纸条。本研究的初步证明了免疫胶体金层析技术建立的快速检测JEV试纸条的方法是可行的,后续进一步完善研究具有良好应用前景。