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新型鸭呼肠孤病毒（Novel duck reovirus,NDRV）病是一种以脾脏肿大、出血、坏死为主要特征的疾病,自2017年以来,发病率和死亡率相对较高,给我国养鸭业造成了严重的经济损失。本研究从临床疑似样品中分离到NDRV,对分离株进行分离鉴定,构建病毒感染模型,制备油乳剂灭活疫苗,为NDRV的防控提供技术支持。本实验室在2017年2019年对来自山东、安徽等地送检的30份疑似患病样品进行RT-PCR检测,结果显示10份样品为阳性。对这10份阳性样品进行病毒分离,接种SPF鸡胚胚体明显出血,接种鸡胚肝细胞产生合胞体病变。分离株测序后对其进行同源性比对分析并绘制遗传进化树,同源性比对结果显示:10株分离株的同源性在97.4%99.4%之间,分离株与DRV经典毒株的同源性在94.6%96.5%之间,说明NDRV较DRV发生明显的变异。遗传进化树结果显示:分离株与水禽源呼肠孤病毒位于同一分支,说明NDRV与水禽源呼肠孤病毒的遗传关系相对较近。通过对分离株进行同源性比对及遗传进化树分析,SDYC株与DRV的同源性差异最大,并根据其致病性及免疫原性的分析,筛选出SDYC株作为疫苗株,对筛选株进行动物回归试验,通过腿部肌肉接种1日龄雏鸭,结果表明,接种0.2mL(TCD50为10-7.2)病毒液后雏鸭出现精神沉郁,食欲减退等临床症状,剖检可见脾脏出血、坏死,肝脏有坏死点等特征性病理变化。将SDYC株病毒液接种鸡胚肝细胞,病毒感染后48h72h收取细胞病毒液。本研究选用转瓶培养方式进行细胞培养和病毒增殖,该方法可快速扩增出大量的抗原液。选用甲醛将抗原液灭活后与吐温-80以94:6的比例混合制备疫苗水相。按照3:2的油水相比进行乳化,制备NDRV油乳剂灭活疫苗。对该疫苗的理化性状,最佳免疫剂量,免疫保护效果及免疫后雏鸭血清中抗体水平变化进行检测。结果表明,最佳灭活条件为0.2%的甲醛溶液37°C灭活24h。疫苗的理化性状及安全性检测结果显示,疫苗剂型为油包水型,物理性状稳定,未检测到细菌以及支原体等微生物,可在4°C保存12个月。对5日龄雏鸭颈部皮下注射1.0mL该灭活疫苗,未出现局部炎性反应及全身性不良反应,表明该疫苗安全性良好。免疫保护试验的结果显示该疫苗的最佳剂量为0.3mL/羽。ELISA OD450值达到0.508时,中和抗体水平达到24时,即可有效抵御NDRV的感染。攻毒保护试验中,非免疫组大部分样品检测结果为阳性,21d以内均检测到样品阳性,说明非免疫组雏鸭长期带毒且排毒。0.1mL免疫组也检测出部分阳性样品。0.3mL1.0mL免疫组仅检测出一个阳性样品,保护率在96%以上。综上所述,本研究制备的NDRV油乳剂灭活苗具有良好的免疫保护效果,能够有效抵抗NDRV的感染。